Държавен вестник, брой 43 от 20.V

Приложение № 1 към чл. 10, ал. 2

Вземане на проба от партиди цитрусови плодове, доставени в опаковки

Приложение № 2 към чл. 10, ал. 3

Вземане на проби от партиди цитрусови плодове, доставени в насипно състояние

Приложение № 3 към чл. 11

Метод за извършване на качествен анализ за остатъци от бифенил, ортофенилфенол и натриев ортофенилфенат в кори от цитрусови плодове

1. Област на приложение - методът осигурява откриването на остатъци от бифенил, ортофенилфенол (ОФФ) и натриев ортофенилфенат в корите на цитрусови плодове.

Границата на чувствителност на метода в абсолютни измерения е приблизително 5 mg за бифенил и 1 mg за ОФФ или натриев ортофенилфенат, което съответно е равно на 5 mg бифенил (5 ppm) и 1 mg ОФФ (1 ppm) респ. в корите на 1 kg цитрусови плодове.

Когато цитрусовите плодове се обработват с посочените консерванти, техни остатъци се откриват предимно в кората на плодовете. Количествен анализ за определянето им в целия плод се налага, когато се установят остатъци от консервантите в корите на плода.

2. Принцип на метода:

2.1. Приготвя се екстрат от кората, като се използва дихлорметан в кисела среда.

2.2. Извършва се концентрация и отделяне на екстракта чрез тънкослойна хромотография с използване на силикагел.

2.3. Наличието на бифенил, ОФФ или натриев ортофенилфенат се показва чрез тестове за флуоресценция и оцветяване.

3. Реактиви:

3.1. Циклохексан (ч.з.а.).

3.2. Дихлорметан (ч.з.а.).

3.3. Солна киселина 25% (w/v).

3.4. Силикагел GF 254 Merck или еквивалентен.

3.5. 0,5 % разтвор на 2,4,7-тринитрофлуоренон (Fluka, B. D. H. или еквивалентен) (ТНФ) в ацетон.

3.6. 0,1 % разтвор на 2,6-дибромо-бензохинон-4-хлоримид в етанол (който е стабилен при съхранение в хладилник до една седмица).

3.7. Концентриран разтвор на амоняк, относ. м.: 0,9.

3.8. Стандартен 1 % разтвор на чист бифенил в циклохексан.

3.9. Стандартен 1 % разтвор на чист ортофенилфенол в циклохексан.

4. Оборудване:

4.1. Миксер.

4.2. Колба от 250 ml с шлифт и обратен хладник.

4.3. Изпарител за ниско налягане.

4.4. Микропипети.

4.5. Апарат за тънкослойна хроматография с измерващи плаки 20 x 20 сm.

4.6. UV лампа (254 nm), чиято интензивност трябва да е такава, че петно от 5 mg бифенил да е видимо.

4.7. Оборудване за пулверизация на реактиви.

4.8. Пещ.

5. Процедура:

5.1. Подготовка на пробата и екстракция.

Всичките плодове в пробата за изпитване се нарязват наполовина. Едната половина от всеки плод се съхранява за количествено определяне на остатъците от бифенил и/или ортофенилфенол. От кората на другата половина се вземат късовете и се прави проба/извадка от около 80 грама. Тези късове се нарязват и раздробяват с миксера и се поставят в колба от 250 ml; към тях се прибавят 1 ml 25 % солна киселина и 100 ml дихлорметан, като сместа се филтрира през нагънат филтър. Сместа се нагрява с обратен хладник за 10 min. След изстудяване и изплакване на кондензатора с около 5 ml дихлорметан сместа се филтрира през нагънат филтър. Разтворът се прехвърля в изпарител и се добавя пемза. Разтворът се концентрира при понижено налягане и температура 60 грасуса С до окончателния обем от около 10 ml. Когато се използва роторен изпарител, колбата трябва да се държи във фиксирано положение, за да се избегне загуба на бифенил чрез образуване на филм от продукта върху горната стена на колбата.

5.2. Хроматография - 30 g силикагел и 60 ml вода се поставят в миксер и се разбъркват 1 min. След това сместа се излива върху 5 хроматографски плаки и се разстила, за да се оформи слой с дебелина приблизително 0,250 mm. Покритите с този слой плаки се подлагат на струя топъл въздух за 15 min., след което се поставят в пещ, където се държат 30 min. при температура 110 грасуса С. След изстудяване всяка плака се разделя на ивици с широчина 2 cm чрез успоредни линии, проникващи през покриващия слой надолу към повърхността на плаката. 50 ml от екстракта за анализ се поставят под формата на редица от капки, една до друга върху всяка ивица, приблизително на 1,5 cm от ръба. Най-малко една ивица се запазва за контрола, която се накапва с 1 ml (което е 10 mg) от стандартните разтвори на бифенил и ортофенилфенол. Хроматографските плаки се проявяват в смес от циклохексан и дихлорметан (25 : 95) в съдове, предварително облицовани с филтърна хартия.

5.3. Откриване и идентификация (определяне).

Наличието на бифенил и ортофенилфенол се показва чрез появата на петна в UV светлина (254 mm). Натриевият ортофенилфенат се променя в ортофенилфенол по време на екстракцията в кисела среда, поради което присъствието му не може да се различи от това на ортофенилфенола. Продуктите се идентифицират по следния начин:

(а) бифенилът дава жълто петно на дневна светлина, когато се напръска с разтвор на TНФ;

(б) ортофенилфенолът дава синьо петно, когато се напръска с разтвор на 2,6-дибромобензохинон-4-хлоримид, последвано от бързо прекарване през струя топъл въздух и излагане на наситена с амоняк атмосфера.

Приложение № 4 към чл. 12

Метод за извършване на количествен анализ за остатъци от бифенил в цитрусови плодове

1. Област на приложение - методът е предназначен за количественото определяне на остатъци от бифенил в цели цитрусови плодове. Точността на метода е ± 10 % за съдържание на бифенил, по-голямо от 10 mg на килограм плодове (10 ppm).

2. Принцип на метода - количеството на остатъците на бифенил в цитрусовите плодове се определя след дестилация в кисела среда и екстракция с циклохексан, като екстрактът се подлага на тънкослойна хроматография върху силикагел. Хроматограмата се развива, бифенилът се извлича и се определя спектрофотометрично при 248 nm.

3. Реактиви:

3.1. Разтвор на концентрирана сярна киселина.

3.2. Антипенообразуваща емулсия на база силиций.

3.3. Циклохексан (ч.з.а.).

3.4. Хексан (ч.з.а.).

3.5. Етанол (ч.з.а.).

3.6. Безводен натриев сулфат.

3.7. Силикагел GF 254 (Merck или еквивалентен).

3.8. Стандартен 1 % разтвор на чист бифенил се разрежда с циклохексан, за да се получат следните три разтвора - 0,6 mg/ml, 1 mg/ml и 1,4 mg/ml.

4. Оборудване:

4.1. Миксер с капацитет 1 литър.

4.2. Двулитрова дестилационна колба с модифициран сепаратор от типа Clevenger съгласно посоченото в приложение № 6 и обратен хладник.

4.3. 10 ml градуирана епруветка.

4.4. 50 ml микропипети.

4.5. Апарат за тънкослойна хроматография с плаки 20 x 20 cm.

4.6. Пещ.

4.7. Центрофуга с 15 ml конични епруветки.

4.8. UV спектрофотометър.

5. Процедура:

5.1. Приготвяне на пробата и екстракция.

Всички плодове в пробата за анализ се разрязват наполовина. Едната половина от всеки плод се запазва за качествен анализ за остатъци от бифенил, ОФФ или натриев ортофенилфенат. Другите половини от плодовете се събират, раздробяват се или се смилат до получаването на хомогенна смес. От нея се вземат за анализ най-малко две проби от по 200 g, които се обработват по следния начин. Всяка от тези проби се поставя в миксер със 100 ml вода и се смесва при ниска скорост за няколко секунди. Добавя се вода, докато обемът на сместа достигне три четвърти от капацитета на миксера, след което се разбърква с пълна скорост за 5 min. Полученото пюре се прехвърля в 2-литрова дестилационна колба. Миксерът се изплаква с вода, която се добавя към съдържанието на колбата. (Общото количество вода, използвана за смесване и изплакване, е 1 l). Към сместа се добавят 2 ml сярна киселина, 1 ml антипенообразуваща емулсия и гранули пемза. Сепараторът и обратният хладник се монтират към колбата. В сепаратора се налива дестилирана вода, докато водното ниво надвиши по-ниското рамо на страничната връщаща тръба, и се прибавят 7 ml циклохексан. Дестилира се за около 2 h. След това съдържанието на сепаратора се събира в 10 ml градуирана епруветка, сепараторът се изплаква с около 1,5 ml циклохексан, които се добавят към съдържанието на епруветката, и обемът се довежда до 10 ml с циклохексан. Накрая се добавя малко безводен натриев сулфат и сместа се разбърква.

5.2. Хроматография - 30 g силикагел и 60 ml вода се поставят в миксер и се смесват за една минута. След това сместа се излива върху 5 хроматографски плаки и се разстила, за да образува слой с дебелина приблизително 0,250 mm. Покритите с този слой плаки се подлагат на струя топъл въздух за 15 min, след което се поставят в пещ, където се държат 30 min при температура 110 грасуса С. След изстудяване всяка плака се разделя на 4 ивици с широчина 4,5 cm чрез успоредни линии, проникващи през слоя на покритието надолу към повърхността на плаката. 50 ml от екстракта за анализ се поставят под формата на редица от капки, разположени близо една до друга, върху една от ивиците на приблизително 1,5 cm от края на плаката. Върху всяка от трите останали ивици се поставят по същия начин 50 ml от стандартните разтвори по т. 3.8, респ. съответстващи на 30, 50 и 70 mg количества бифенил.

Когато анализите се извършват в серии, не е необходимо стандартните разтвори да се поставят върху всяка плака и стандартната крива може да се получи от средния размер на стойностите, получени от най-малко 5 плаки с еднакви стандартни количества.

5.3. Развиване на хроматограмите и извличане.

Хроматограмите се развиват с хексан до височина 17 cm в съдове, предварително облицовани с филтърна хартия. Плаките се изсушават на въздух. Местата, в които се локализира бифенилът, се откриват под UV светлина (254 nm) и се маркират с правоъгълници с еднакви площи. Така маркираните области веднага се изстъргват до чисто с шпатула през целия слой силикагел. Бифенилът се извлича от изстърганото с 10 ml етанол за 10 min при неколкократно разклащане. Сместа се прехвърля в центрофужни епруветки и се центруфугира за 5 min при 2500 оборота/min.

Контролна проба от силикагела със същата площ се обработва чрез същия метод. Когато анализите се извършват в серии, тази контролна площ се взема от неизползвана ивица на плаката, под фронта на разтворителя. Когато анализите се извършват индивидуално, тя се взема от една от ивиците, съдържаща стандартен разтвор, от място, което е разположено под зоната, съдържаща бифенила.

5.4. Спектрофотометрично определяне.

Надстоящата течност се отлива в спектрофотометричните кювети и екстинкцията се определя при 248 nm, като се сравнява с контролна проба от хроматографска зона, свободна от бифенил.

5.5. Изчисляване на резултатите

Чертае се стандартна крива, като се нанасят стойностите на бифенила от 30, 50 и 70 mg срещу съответните стойности на екстинкцията им, както са определени на спектрофотометъра. Това дава права линия, която преминава през началото на координатната система. Тази графика позволява бифенилното съдържание на пробите да се отчете директно в ppm, от стойността на екстинкцията екстрактите.

Приложение № 5 към чл. 13

Метод за извършване на количествен анализ на остатъци от ортофенилфенол и натриев ортофенилфенат в цитрусови плодове

1. Област на приложение - методът е предназначен за извършване на количествен анализ на остатъците от ортофенилфенол (ОФФ) и натриевия ортофенилфенат в цели цитрусови плодове. Методът дава резултати за съдържание на ОФФ или натриев ортофенилфенат от порядъка на 12 ppm, които са ниски средно с 10% до 20%.

2. Принцип на метода - определянето на количеството на остатъците от ортофенилфенол и натриев ортофенилфенат в цитрусови плодове се извършва след дестилация в кисела среда и извличане чрез ди-изопентилов етер, екстрактът се пречиства и обработва с разтвор на 4-амино-2,3-диметил-1-фенил-3-пиразолин-5-он(= 4-аминоантипирин). Появява се червен цвят, чиято интензивност се измерва чрез спектрофотометрия при 510 nm.

3. Реактиви:

3.1. 70 % ортофосфорна киселина.

3.2. Антипенообразуваща емулсия на база силиций.

3.3. Ди-изопентилов етер (ч.з.а.).

3.4. Пречистен циклохексан, който се разклаща 3 пъти с 4 % разтвор на натриев хидроокис и се измива 3 пъти с дестилирана вода.

3.5. 4 % разтвор на натриев хидроксид.

3.6. Буферен разтвор с pH 10,4: в 2-литрова градуирана колба се слагат 6,64 грама борна киселина, 8,00 g калиев хлорид и 93,1 ml N разтвор на натриев хидроксид, които се смесват се и се довеждат до мярката с дестилирана вода.

3.7. Реактив I. Разтваря се 1,0 g от 4-амино-2,3-диметил-1-фенил-3-пиразолин-5-он (= 4-аминотипирин) в 100 ml дестилирана вода.

3.8. Реактив II. Разтварят се 2,0 g калиев фероцианид в 100 ml дестилирана вода.

Реактиви I и II трябва да се съхраняват в кафяви стъклени шишета и са годни само за около 14 дни.

3.9. Силикагел.

3.10. Стандартен разтвор. Разтварят се 10 mg чист ОФФ в 1 ml от 0,1 N NaOH и се разрежда до 100 ml с 0,2 М разтвор на натриев борат (1 ml = 100 mg). За стандартен разтвор се разрежда в отношение 1 : 10 с буферния разтвор.

4. Оборудване:

4.1. Раздробяваща или смачкваща мелничка.

4.2. Миксер.

4.3. Еднолитрова дестилационна колба с модифициран сепаратор от типа Clevenger, посочен в приложение № 6, и обратен хладник.

4.4. Инфрачервена вана.

4.5. 200 ml делителна фуния.

4.6. Градуирани цилиндри от 25 и 100 ml.

4.7. Градуирани колби от 25 и 100 ml.

4.8. 1 до 10 ml пипети.

4.9. 0,5 ml градуирани пипети.

4.10. Спектрофотометър с кювети от 5 cm.

5. Процедура:

Всички плодове в пробата за анализ се разрязват наполовина. Едната половина от всеки плод се запазва за качествен анализ за остатъци от бифенил, ОФФ или натриев ортофенилфенат. Другите половини от плодовете се събират, раздробяват се или се смилат до получаването на хомогенна смес. От нея се вземат за анализ най-малко две проби от по 250 g, които се обработват по следния начин. Всяка от тези проби се поставя в миксер с 500 ml вода и се смесва до получаване на много фина хомогенна смес, в която не се наблюдават мастни капки. От пюрето се взема проба от 150 до 300 g в зависимост от предполагаемото съдържание на ОФФ и се поставя в еднолитрова дестилационна колба с количество вода, което е достатъчно да разреди сместа до 500 g. След добавяне на 10 ml 70 % ортофосфорна киселина, гранули пемза и 0,5 ml антипенообразуваща емулсия се монтират сепараторът и обратният хладник към колбата. В сепаратора се поставят10 ml ди-изопентилов етер и колбата се загрява внимателно в инфрачервена вана, при което не се допуска пюрето да заври или да образува пяна. След дестилиране за около 6 h съдържанието на сепаратора се излива в 200 ml делителна фуния. Сепараторът и кондензаторът се изплакват с 60 ml циклохексан и след това с 60 ml вода, които се прибавят към съдържанието на делителната фуния. Сместа се разклаща силно и когато фазите се разделят, се изхвърля водната фаза.

За извличане на ОФФ органичната фаза се разклаща силно 5 пъти, всеки път за 3 минути с 10 ml 4 % натриев хидроокис. Алкалните разтвори се смесват, неутрализират се до pH 9-10 с ортофосфорна киселина в присъствието на фенолфталеинова хартия и се разреждат до 100 ml с дестилирана вода. Добавя се щипка силикагел с цел да се избистри разтворът, който има леко мътен вид. След това разтворът се разклаща и филтрира през сух, финозърнест филтър. Тъй като оцветяването се развива с максимална точност и прецизност при използването на количества от ОФФ между 10 и 70 mg, се взима с пипета една аликвотна извадка между 0,5 и 10 ml разтвор, като се имат предвид количествата ОФФ, които се очаква да бъдат открити. Пробата се поставя в 25 ml градуирана колба; към нея се добавят 0,5 ml от реагент I, 10 ml от буферния разтвор и накрая 0,5 ml от реагент II. Сместа се довежда до калибровачния белег с буферния разтвор и се разклаща силно.

След 5 min екстинцията на червеното оцветяване се измерва със спектрофотометър при 510 nm срещу контролна проба, която не съдържа екстракт. Цветът не загубва интензивност в рамките на 30 min. Оценката се извършва, като се направи отнасяне към стандартна крива, начертана при същите условия с използване на стандартен разтвор на ОФФ.

6. Наблюдения.

За всеки анализ се препоръчва спектрофотометричното определяне да се извършва при повторение с различни обеми на нeутрализирания алкален екстракт.

По този метод необработените цитрусови плодове дават "празно, фоново" отчитане до 0,5 ppm за портокали и 0,8 ppm за лимони.

Приложение № 6 към чл. 14

Модифициран сепаратор тип Clevenger