Държавен вестник, брой 111 от 26.XI

§ 1. В чл. 6, чл. 9, т. 11, чл. 16, ал. 1, т. 4 думите "БДС "Вода за пиене" се заменят с "изискванията на Наредба № 9 от 2001 г. за качеството на водата, предназначена за питейно-битови цели (ДВ, бр. 30 от 2001 г.)".

§ 2. В чл. 10 се правят следните изменения и допълнения:

1. Досегашният текст става ал. 1 и се създава т. 3:

"3. съоръжения за измерване на количеството и вземане на средна проба и за първичен анализ."

2. Създава се ал. 2:

"(2) Млекосъбирателният пункт може да се намира и във фермата на млекопроизводителя, когато са изпълнени изискванията по ал. 1."

§ 3. В чл. 14, т. 4 думите "съгласно чл. 25" се заменят със "съгласно чл. 49".

§ 4. В чл. 20 се правят следните изменения и допълнения:

1. Създава се ал. 4:

"(4) При изследването на сурово мляко се спазват изискванията за:

1. вземане на проби от сурово мляко съгласно метода, посочен в приложение № 4;

2. определяне на точката на замръзване на сурово мляко съгласно метода, посочен в приложение № 5;

3. определяне на общия брой микроорганизми при 30 градуса С съгласно метода, посочен в приложение № 6;

4. определяне на соматичните клетки съгласно метода, посочен в приложение № 7;

5. доказване на антибиотици и сулфонамиди съгласно метода, посочен в приложение № 8."

2. Досегашните ал. 4 и 5 стават съответно ал. 5 и 6.

§ 5. В чл. 22, т. 12 думите "минус 0,52 градуса С" се заменят с "минус 0,520 градуса С".

§ 6. В чл. 28 се правят следните изменения и допълнения:

1. Досегашният текст става ал. 1 и в нея:

а) в т. 2 думите "фосфатазов" и "пероксидазов" се заменят с "фосфатазен" и "пероксидазен";

б) в т. 2 на края се добавя: "определянето на фосфатазната активност се извършва съгласно метода, посочен в приложение № 9; пероксидазната активност се определя съгласно метода, посочен в приложение № 10."

2. Създава се ал. 2:

"(2) При изследване на пастьоризирано мляко се спазват изискванията за:

1. вземане на проби от пастьоризирано мляко съгласно метода, посочен в приложение № 4;

2. определяне на точката на замръзване съгласно метода, посочен в приложение № 5;

3. определяне на общия брой психротрофни микроорганизми при 21 градуса С и общ брой микроорганизми при 30 градуса С съгласно методите, посочени съответно в приложения № 11 и № 6;

4. определяне на общия брой колиформи след култивиране при 30 градуса С съгласно приложение № 12;

5. доказване на антибиотици и сулфонамиди съгласно метода, посочен в приложение № 8;

6. доказване на патогенни микроорганизми съгласно метода, посочен в приложение № 13."

§ 7. В чл. 29 се правят следните изменения и допълнения:

1. Досегашният текст става ал. 1.

2. Създава се ал. 2:

"(2) При изследване на мляко, произведено по UHT технология, се спазват изискванията за:

1. вземане на проби от мляко, произведено по UHT технология, съгласно метода, посочен в приложение № 4;

2. определяне на точката на замръзване на мляко, произведено по UHT технология, съгласно метода, посочен в приложение № 5;

3. определяне на общия брой микроорганизми при 30 градуса С съгласно метода, посочен в приложение № 6;

4. доказване на антибиотици и сулфонамиди съгласно метода, посочен в приложение № 8."

§ 8. В чл. 30 се създава ал. 3:

"(3) При изследване на стерилизирано мляко се спазват изискванията за:

1. вземане на проби от стерилизирано мляко съгласно приложение № 4;

2. определяне на точката на замръзване на стерилизирано мляко съгласно метода, посочен в приложение № 5;

3. определяне на общия брой микроорганизми при 30 градуса С съгласно метода, посочен в приложение № 6;

4. доказване на антибиотици и сулфонамиди съгласно метода, посочен в приложение № 8."

§ 9. В чл. 31, ал. 1 думата "пероксидазов" се заменя с "пероксидазен".

§ 10. В чл. 34, ал. 5, т. 2 думите "фосфатазов" и "пероксидазов" се заменят с "фосфатазен" и "пероксидазен".

§ 11. Заглавието на глава пета се изменя така: "Опаковане и пакетиране".

§ 12. В чл. 37, ал. 1 се правят следните изменения и допълнения:

1. Алинея 1 се изменя така:

"(1) Продуктите по чл. 1, т. 1 носят здравна маркировка."

2. В ал. 5 и 6 думата "овално" се заменя с "елипсовидно".

3. Създава се ал. 6:

"(6) Здравната маркировка на предприятия по чл. 43, ал. 4 съдържа данните по ал. 5 без инициалите "BG" и е с кръгла форма."

4. Досегашните ал. 6, 7, 8 и 9 стават съответно ал. 7, 8, 9 и 10.

§ 13. В чл. 38 се правят следните изменения:

1. Създава ал. 1:

"(1) Етикетирането на продуктите по чл. 1, т. 1 се извършва при условията и по реда на Наредбата за етикетирането и представянето на храните (приета с ПМС № 136 от 2000 г., ДВ, бр. 62 от 2000 г.)."

2. Досегашната ал. 1 става ал. 2.

§ 14. В чл. 43 ал. 4 се изменя така:

"(4) За предприятия с капацитет на производство до един тон дневно не се прилагат изискванията по:

1. чл. 9, т. 12 - относно самостоятелни съблекални;

2. чл. 13, ал. 1, т. 4 и 8 - относно отделни помещения за приемане и пастьоризиране на млякото;

3. чл. 13, ал. 1, т. 8, букви "б" и "в"."

§ 15. Глава единадесета се отменя.

§ 16. В допълнителната разпоредба се правят следните изменения:

1. Точка 10 се отменя.

2. Точка 11 се изменя така:

"11. "Опаковане" е операция, предназначена да предпази млечните продукти от заразяване чрез използване на първоначална опаковка или първоначален контейнер."

3. Създават се т. 19, 20, 21 и 22:

"19. "Пакетиране" е поставянето на един или повече опаковани или неопаковани продукти във втори контейнер.

20. "Материал за пакетиране" е вторият

контейнер, в който се поставят опакованите продукти.

21. "Опаковка" е използваният материал за опаковане или контейнер, когато са в пряк контакт с продуктите.

22. "Първичен анализ" е изследване на суровото мляко в млекосъбирателния пункт в присъствието на представител на млекопреработвателното предприятие."

§ 17. В преходните и заключителните разпоредби се правят следните изменения:

1. В § 2 след думите "в съответствие с изискванията, посочени в нея" се добавя "с изключение на:

а) чл. 9, т. 3, букви "а" и "б" - в частта относно заоблени ъгли между стените и пода, буква "д" - в частта относно система за отстраняване на водните пари, които влизат в сила от 31.ХII.2003 г.;

б) чл. 13, ал. 1, т. 3 - в частта относно калибрирана температурно измервателна апаратура, т. 8, букви "а", "б" и "г", които влизат в сила от 31.ХII.2003 г."

2. Параграф 3 се изменя така:

"§ 3. (1) Суровото мляко, което се добива в стопанства, отговарящи на изискванията по чл. 16 - 20, трябва да отговаря на показателите общ брой микроорганизми (ОБМ) и общ брой соматични клетки (ОБСК), определени по количества и периоди, както следва:

1. през периода 2002 до 31.ХII.2005 г. - на показателите ОБМ и ОБСК, посочени в приложение № 3 от Наредба № 30 за ветеринарно-санитарните и хигиенните изисквания при добива на сурово мляко, изграждане и експлоатация на млекопреработвателни предприятия, производството и търговията с топлинно обработено мляко и млечни продукти, както следва:

а) първо качество краве мляко - до 500 000/мл ОБМ и ОБСК;

б) първо качество овче и козе мляко - до 1 500 000/мл ОБМ;

в) първо качество биволско мляко - до 1 000 000/мл ОБМ и до 500 000/мл ОБСК;

2. през периода от 1.I.2006 г. до 31.ХII.2007 г. - на следните показатели:

а) екстра качество краве мляко - до 300 000/мл ОБМ и до 400 000/мл ОБСК;

б) първо качество овче и козе мляко - до 1 500 000/мл ОБМ;

в) първо качество биволско мляко - до 1 000 000/мл ОБМ и до 500 000/мл ОБСК;

3. през периода от 1.I.2008 г. до 31.ХII.2009 г. - на изискванията за ОБМ и ОБСК, които са по-ниски от равнищата за 2006 - 2007 г., за да могат да достигнат изискванията на приложение № 1 към чл. 23 през 2009 г.:

а) сурово краве мляко - до 100 000/мл ОБМ и до 400 000/мл ОБСК;

б) сурово овче и козе мляко - до 1 500 000/мл ОБМ;

в) сурово биволско мляко - до 1 000 000/мл ОБМ и до 500 000/мл ОБСК.

(2) Продуктите, произведени до 2009 г. от мляко, което не отговаря на показателите за ОБМ и ОБСК по ал. 1, се маркират със здравната маркировка по чл. 37, ал. 6 и могат да се предлагат само на пазара в страната."

3. Параграф 4 се изменя така:

"§ 4. Наредбата се издава на основание чл. 60 от Закона за ветеринарномедицинската дейност и отменя Наредба № 29 от 1995 г. за ветеринарно-санитарните и хигиенните изисквания при изграждане и експлоатация на млекопреработвателни предприятия (ДВ, бр. 106 от 1995 г.) и Наредба № 3 от 1998 г. за добив, изкупуване и окачествяване на сурово мляко (ДВ, бр. 12 от 1998 г.)."

§ 18. Навсякъде в наредбата думите "одобрени национални референтни лаборатории" и "национални оторизирани лаборатории" се заменят с "национална референтна лаборатория", думите "преопаковащи цехове" се заменят с "препакетиращи цехове", а думата "изкупваемо/то" се заличава.

§ 19. В приложение № 1 в т. 3, първо изречение думата "биволско" се заличава.

§ 20. В приложение № 2 се правят следните изменения и допълнения:

1. В задължителни критерии: патогенни микроорганизми буква "в" се изменя така: "в) двадесет и пет грамовите проби се състоят от пет вземания (единици) от по пет грама, взети от различни части на продукта." и се добавя:

"Когато тези стандарти са превишени, храните не се използват за човешка консумация и се изтеглят от пазара съгласно чл. 49, т. 6 и 7.

Програмите за вземане на проби се съставят в зависимост от вида на продукта и анализа на риска."

2. В аналитични критерии: организми, показващи лоша хигиена, се правят следните изменения:

а) в таблицата за стафилококус ауреус след замразени млечни продукти (вкл. сладолед) се добавя:

"

саламурени сирена, парени сирена	m	=	10
	M	=	100
	n	=	5
	c	=	2
йогурт	m	=	0
	M	=	10
	n	=	5
	c	=	2"

б) в таблицата за Е. коли след меки сирена (произведени от топлинно обработено мляко) се добавя:

"саламурени сирена, парени сирена	m	=	10
	M	=	100
	n	=	5
	c	=	2
йогурт	m	=	0
	M	=	10
	n	=	5
	c	=	2"

в) след таблицата се добавя:

"Във всички случаи, когато тези стандарти са превишени, се проверява изпълнението на методите за мониторинг и критичните точки, прилагани в преработвателното предприятие съгласно чл. 49. Органите на НВМС се информират за корективните процедури, включени в мониторинговата програма на производството за предпазване от повторно превишаване на стандартите.

Когато стандартът М е превишен - за сирене от сурово, термизирано мляко и меко сирене, се извършва изследване за вероятно наличие на ентеротоксиногенни щамове на S. Aureus или E. Cоli, за които се предполага, че са патогенни, и когато е необходимо - за наличие на токсини на стафилококи в такива продукти. Когато се установят посочените щамове и/или стафилококови ентеротоксини, всички партиди, в които са установени, се изтеглят от пазара. В този случай органите на НВМС се информират за измененията съгласно чл. 49, т. 6 за предприетите действия за изтегляне на съмнителните пратки и корективните процедури, включени в производствената мониторингова програма."

3. В индикаторни организми: основни насоки:

а) в таблицата колиформни 30 градуса С след замразени млечни продукти (вкл. сладолед) се добавя:

"саламурени сирена, парени сирена	m	=	100
	M	=	1000
	n	=	5
	c	=	2
йогурт	m	=	0
	M	=	5
	n	=	5
	c	=	2"

б) в буква "а" думите "при 60 градуса С" се заменят с "при 6 градуса С";

в) думите "културален метод" се заменят с "психротрофни микроорганизми";

г) след буква "б" се добавя:

"Тези основни насоки могат да помогнат на производителите за осигуряване на правилна работа на предприятията им и за изпълнение на системата и процедура за извършване на техните собствени проверки при производството им."

4. В микробиологични критерии за мляко за пиене в т. 1, буква "а" означението "І 10" се изменя така: "І 50 000".

5. В т. 4, буква "а" думите "при 3 градуса С" се заменят с "при 30 градуса С".

§ 21. В приложение № 3 "Изисквания към качеството на суровото краве мляко" се правят следните изменения и допълнения:

1. В т. 1.1 текстът "Директиви 92/46 и 94/71 на Съвета на Европейската общност" се заменя с "Наредба № 30 от 2001 г. за ветеринарно-санитарните и хигиенните изисквания при добива на сурово мляко, изграждане и експлоатация на млекопреработвателни предприятия, производството и търговията с топлинно обработено мляко и млечни продукти (ДВ, бр. 1 от 2001 г.)".

2. Точка 2.1 в таблицата т. 12 "Температура на охлаждане, градуса С, не по-висока от: екстра качество - 4 градуса С, първо качество - 4 градуса С, второ качество - 4 градуса С" се изменя така: "Температура на охлаждане, градуса С, не по-висока от: екстра качество - 4 градуса С, първо качество - 8 градуса С, второ качество - 10 градуса С."

3. В т. 3.2 текстът след думите "на съответните нормативни актове" се заличава.

4. В "Изисквания към качеството на сурово мляко овче", т. 3.2 текстът след думите "на съответните нормативни актове" се заличава.

5. В таблицата, т. 14 означението "800" се заменя с "1500", а т. 15 се отменя.

6. В "Изисквания към качеството на сурово мляко козе", т. 3.2 текстът след думите "на съответните нормативни актове" се заличава.

7. В таблицата т. 15 се отменя.

8. В "Изисквания към качеството на сурово мляко биволско" т. 4, 5, 6 и 7 се отменят.

Приложение № 4 към чл. 20, ал. 4

Вземане на проби от сурово и топлинно обработено мляко

I. Общи разпоредби

1. Реактиви

1. Вода

1.1. Под вода, която се използва за разтвор, разреждане или промиване, се разбира дестилирана, дейонизирана или деминерализирана вода с равностойна чистота. За целите на микробиологичния анализ тя трябва да бъде стерилна и да не съдържа вещества, които могат да засегнат или повлияят на растежа на микроорганизмите по време на изследване.

1.2. Под "разтвор" или "разреждане", за които няма допълнителни указания, се разбира "разтвор във вода" или "разреждане с вода".

2. Химикали

Използваните химикали трябва да бъдат чисти за анализ субстанции (ч.а.с.).

2. Апаратура

1. Списък на апаратурата

Апаратурата, която се използва за отделните референтни методи, трябва да се състои само от части, предназначени за специализирана употреба, и части, които са обект на конкретна спецификация.

2. Аналитични везни

Под "аналитична везна" се разбира везна със стойност на едно деление от скалата 0,1 mg.

3. Изчисляване на резултатите

1. Резултати

Обявените в протокола от анализа резултати се изчисляват като средна аритметична стойност, която е получена от две изследвания, които отговарят на критерия за повторяемост, определен за съответния метод. В случай че критерият за повторяемост не е изпълнен, изследването се повтаря. Ако повторението е невъзможно, резултатът от първия тест се обявява за невалиден.

2. Изчисляване на процентното съдържание

Резултатите от изследванията се изчисляват като проценти от масата на пробата.

4. Критерии за точност на определянето: повторяемост и възпроизводимост

1. Критериите за точност на определянето за всеки отделен метод са, както следва:

а) повторяемост (r) - стойността, под която се отчита абсолютната разлика между резултатите от две отделни изследвания, получени чрез прилагането на една и съща процедура върху идентичен тест-материал при еднакви условия на провеждане (лице, което провежда изследването, апаратура, лаборатория и през кратък интервал от време);

б) възпроизводимост (R) - стойността, под която се отчита абсолютната разлика между резултатите от две отделни изследвания, получени при прилагането на една и съща процедура върху идентичен тест-материал, но в различни условия (различни лица, провеждащи изпитанието, апаратура, лаборатории и време на провеждане);

в) за всеки отделен метод стойностите за изпълнение на критериите за повторяемост и възпроизводимост за всяка процедура трябва да са в доверителните граници на 95 %.

5. Протокол от изследването

В протокола се отбелязват използваният метод на анализ и получените от изследването резултати. Допълнително се записват подробна информация за приложената неспецифична или незадължителна за метода на анализа процедура, както и всички останали обстоятелства, които биха могли да повлияят на получените резултати, и допускът на показателя. Протоколът трябва да съдържа всички данни, необходими за идентификацията на пробата.

II. Вземане на проби от сурово и топлинно обработено мляко

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за вземане на проби от сурово и топлинно обработено мляко. Процедурите за вземане на проби, тяхното транспортиране и съхранение се прилагат за:

а) сурово мляко от производител;

б) сурово и топлинно обработено мляко в танкове за съхранение и транспорт.

Процедурите, описани в т. 2, 4.4.1, 5 и 6, се отнасят до вземането на проби от топлинно обработено мляко, предназначено за пряка консумация.

2. Общи правила за вземане на проби

Вземането на проби от сурово и топлинно обработено мляко от бидони, танкове и други съдове се извършва от квалифициран персонал, който е преминал необходимото предварително обучение.

Органите на НВМС провеждат обучение на персонала, който отговаря за вземането на проби, за запознаване със специални техники и начини за вземане на пробите, които гарантират представителността и съответствието на пробата с цялата партида мляко, както и за начините за маркиране на изследвания материал, които осигуряват точно обозначение и идентифициране на пробите.

3. Прибори и апаратура за вземане на проби

3.1. Общи изисквания

Приборите и апаратурата за вземане на проби трябва да бъдат изградени от здрав материал от неръждаема стомана, конструирани за съответната цел (разбъркване, вземане на проби и т. н.). Буталата, сондите и бъркалките, използвани за разбъркване на течностите в контейнерите, трябва да имат достатъчна повърхност, която осигурява разбъркване на продукта, и да не влияят върху вкуса на млякото. Лъжиците трябва да имат достатъчно дълга и здрава дръжка, която позволява вземането на млечна проба от дълбочината на контейнера. Вместимостта на лъжицата трябва да бъде не по-малко от 50 ml.

Контейнерите, в които се поставят пробите и запушалките, трябва да са от стъкло, подходящ метал или пластмаса.

Материалът, от който са направени приборите и апаратурата за вземане на проби (вкл. и контейнерите и запушалките), не трябва да влияе върху резултатите от изследването. Всички повърхности на използваните приспособления и апаратура за вземане на проби трябва да са гладки, със заоблени ръбове, без пукнатини, чисти и сухи.

3.2. Прибори и апаратура за вземане на проби за микробиологично изследване

Освен на изискванията по т. 3.1 приборите и апаратурата, вкл. и контейнерите, в които се поставя пробата, трябва да бъдат стерилни. Ако се използват повторно, те трябва да бъдат измити и стерилизирани в съответствие с изискванията на националната референтна лаборатория, което осигурява достоверността на пробата.

4. Начини за вземане на проби

4.1. Общи изисквания

Млякото трябва да се разбърка (от 10 до 15 пъти) чрез ръчни или механични средства преди вземането на пробата независимо от вида на изследванията, които се провеждат. Пробата се взема непосредствено след разбъркване на млякото, преди течността да е достигнала състояние на покой. При едновременното вземане на проби от танкове за различни изследвания най-напред се взема пробата за микробиологично изследване.

Обемът на пробата трябва да отговаря на изискванията за изследване. Контейнерите, в които се поставят пробите, трябва да имат вместимост, която позволява да бъдат почти изцяло напълнени с пробата, да осигурява смесване на съдържанието преди изследването и да препятства отделянето на мазнини при транспортиране.

4.2. Ръчно вземане на проби

4.2.1. Вземане на проби от гюмове и бидони

Млякото се размесва чрез бързо движение нагоре и надолу на буталото в бидона или гюма, което осигурява добро разбъркване на млякото и не позволява по гърлото на съда да се отложи сметана. Представителна проба за цялата партида се взема в съответствие с т. 4.2.4.

4.2.2. Вземане на проби от охладени танкове или вани от стопанствата

Млякото се размесва механично или ръчно, докато се хомогенизира.

Ако количеството мляко не е достатъчно за работата на механичната бъркалка, манипулацията се извършва ръчно.

4.2.3. Вземане на проби от мерителен съд

При изсипване на млякото в мерителен съд то трябва да се разбърка. При необходимост може да се разбърка допълнително ръчно или механично, за да се осигури равномерното разпределение на мазнината в него. Когато обемът на партидата, от която се взема пробата, е по-голям от вместимостта на мерителния съд, се прави представителна за цялата партида проба съгласно изискванията по т. 4.2.4.

4.2.4. Вземане на проби от партида мляко в различни контейнери

Когато млякото, от което се взема проба, е поставено в повече от един контейнер, от всеки контейнер се взема представително количество, като се отчита неговото количество. Частите от представителните количества се смесват пропорционално на количеството мляко, съдържащо се в контейнера, от който е взета пробата, освен ако млечните проби от всеки контейнер не се изследват поотделно. Проби от съответните пропорционални количества мляко в контейнерите се вземат след разбъркване.

4.2.5. Вземане на проби от големи съдове - танкове, предназначени за съхранение, железопътен и автомобилен транспорт на млякото

4.2.5.1. Преди вземане на пробите млякото се разбърква чрез съответната процедура.

За смесване на съдържанието в големи съдове за съхранение на млякото при железопътен или автомобилен транспорт се препоръчва механично разбъркване (вж. т. 4.2.5.2).

Степента на разбъркване трябва да съответства на времето, в което млякото е било в покой. Ефективността на разбъркването за всеки отделен случай се определя в зависимост от целите на предвидения анализ. Критерият за ефективност на разбъркването на млякото влияе на еднаквостта на резултатите от изследването на проби, взети от различни части на партидата или от отвора на танка през различни интервали на изпразване на съда. Разбъркването на млякото е резултатно и ефективно, ако разликата в масленото съдържание на две проби, взети при тези условия, е по-малка от 0,1 %.

В големи съдове с долно изпускане е възможно събирането на малко количество мляко при отвора, което не е представително за цялото съдържание на съда дори и след разбъркване. Затова се препоръчва вземането на пробите да се извършва чрез ревизионен отвор (люк). За да се осигури представителността на проба, взета от отвора за източване, се изпуска достатъчно количество мляко.

4.2.5.2. Разбъркването в големи съдове за съхранение на млякото при железопътен или автомобилен превоз се осъществява чрез:

а) механична бъркалка, вградена в танка и задвижвана от електромотор;

б) перка или бъркалка, потопена в млякото, задвижвана от електромотор и монтирана на ревизионния отвор;

в) за цистерни за железопътен и автомобилен превоз на млякото - чрез рециркулация на млякото през ръкава (маркуча) за прехвърляне на течността, прикрепен към източващото помпено устройство на цистерната, въведен през ревизионния отвор;

г) чрез чист филтриран въздух под налягане, като се използват минимално въздушно налягане и обем, за да се избегне създаването на неприятен, гранясал мирис.

4.3. Автоматично или полуавтоматично вземане на проби

Автоматичните и полуавтоматичните уреди за вземане на проби от сурово мляко от производител се използват при спазване на указанията на лабораторията, която провежда изследването.

Преди и периодично по време на използването им уредите се подлагат на калибриране в съответствие с изискванията на производителя. Приложимостта на процедурите за вземане на проби се проверява с цел да се определят:

а) минималният обем събрано мляко, от което могат да се вземат проби;

б) задържаното количество, което е свързано с минималния обем на пробата;

в) възможността за получаване на представителна проба след правилното разбъркване на цялото количество.

При използването на автоматични или полуавтоматични уреди органите на НВМС определят:

а) минималния обем мляко, от което се взема пробата;

б) минималния обем на пробата;

в) максималното задържано количество;

г) вида на анализа, който следва да се извърши, и предпазните мерки.

4.4. Вземане на проби от топлинно обработено мляко, предназначено за пряка консумация от човека, в разфасовки за директна консумация

Пробите от топлинно обработено мляко в разфасовки за директна консумация не се вземат в отделни съдове, а се представят в херметичен материал за пакетиране. При възможност пробите трябва да се вземат директно от машината за пакетиране или помещението за охлаждане или замразяване на предприятието непосредствено след преработката, а за пастьоризираното мляко - в деня на преработката.

Пробите от всеки отделен вид топлинно обработено мляко (пастьоризирано, произведено по UHT технология или стерилизирано) се вземат в брой, който съответства на броя на предстоящите изследвания съгласно указанията на органите на НВМС.

Пробата се придружава с документ (акт за вземане на проби), който съдържа:

- дата и място на пробовземането;

- име и адрес на производителя;

- имена на пробовземателя и свидетели;

- точен метод на пробовземане, ако се разминава от инструкцията и количеството проба пропорционално на партидата (л);

- произход на партидата, маркировъчен код, номер на пробата, съответстващ на този на партидата;

- място, където се изпращат пробите и за какво изпитване;

- по-специална информация, свързана с продукта (при трудност за осъществяване хомогенност на продукта се посочва използваният консервант);

- вземане на резервна проба за температурен контрол по време на транспортиране до изпитвателната лаборатория при необходимост.

В случай на съгласуване между две страни се вземат допълнителни дубъл проби, които се пазят за арбитражни цели.

5. Идентификация на пробата

Пробата се маркира с идентификационен код, който позволява лесното и бързото й идентифициране (вж. т. 2).

6. Транспортиране и съхранение на пробите

Органите на НВМС изготвят инструкции относно условията за транспортиране, съхранение и времето между вземането на пробата и анализа на млякото в зависимост от вида мляко и метода на последващия анализ.

Те включват:

1. предпазните мерки, които трябва да се вземат по време на транспорта и съхранението с цел пробите да не се излагат на пряка слънчева светлина и влиянието на вредни миризми; ако контейнерът, в който е поставена пробата, е прозрачен, той трябва да се съхранява на тъмно;

2. пробите от сурово мляко за микробиологичен анализ се транспортират и съхраняват при температура между 0 и 4градуса C; времето между вземането на пробата и изследването й до 1.I.2007 г. трябва да е до 12 часа; след тази дата времето между вземането на пробата и изследването й трябва да е до 36 часа; органите на НВМС могат да допуснат млякото да бъде съхранявано и при температура от 0 до 6градуса C, ако времето между вземането на пробата и анализа е до 24 часа;

3. пробите от пастьоризирано мляко за микробиологичен анализ се транспортират и съхраняват при температура от 0 до 4градуса C; времето между вземането на пробата и изследването й трябва да е до 24 часа;

4. пробите за микробиологичен анализ на мляко, различно от суровото и пастьоризираното, се съхраняват при хладилни условия, а времето между вземането им и анализа трябва да бъде възможно най-кратко.

Приложение № 5 към чл. 20, ал. 4

Определяне точката на замръзване

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за определяне точката на замръзване на сурово, пастьоризирано, произведено по UHT технология и стерилизирано пълномаслено, частично и напълно обезмаслено мляко чрез криоскоп (термистор), в който термостатично регулираната баня се охлажда чрез електрическо изстудяване, а живачният термометър е заменен от термисторна сонда.

Използват се два вида уреди. Единият проследява достигането на максималната точка на замръзване върху "платото" на кривата на замръзване, а другият по търговски съображения е конструиран да отчита стойностите през точно определени интервали от време след началото на замръзването. В зависимост от различните криви на замръзване както на различните видове мляко, така и на млякото и стандартните разтвори референтният метод налага използването на уреди от първия тип, т. е. проследяващи достигането на плато от кривата. Уредите с определен интервал на отчитане могат да се използват като рутинни контролни измервания.

Точката на замръзване може да се използва за определяне количеството примеси на вода в млякото, ако киселинността на пробата не надвишава 0,18 g млечна киселина в 100 ml (20 градуса Т) (вж. т. 7.4).

2. Определение

Точка на замръзване на млякото е стойността, получена чрез измервания, проведени съгласно описания метод, и изразена в градуси по Целзий (градуса C).

3. Принцип

Определена тест-порция от млякото се преохлажда до съответната температура в зависимост от уреда и чрез механична вибрация, която води до покачване на температурата до определено плато, съответстващо на точката на замръзване на пробата, се предизвиква кристализация.

Уредът се калибрира чрез нагласяване за получаване на точни резултати за два стандартни разтвора чрез същата процедура, която се използва за пробата мляко. При тези условия платото съответства на точката на замръзване на млякото в градуси по Целзий.

4. Апаратура и лабораторна стъклария

4.1. Криоскоп

Криоскоп. Положение на епруветката с пробата мляко спрямо стъкления край на термисторната сонда и бъркалката

Криоскопът се състои от термостатично регулирана охлаждаща баня, термисторна сонда (полупроводников резисторен термометър) със свързана с нея електрическа верига и галванометър или отчитащо устройство, бъркалка за проби, уред за иницииране на замръзване, епруветки за проби.

4.1.1. Охлаждаща баня

Използват се два вида охлаждащи бани:

4.1.1.1. Имерсионен вид

Добре изолирана баня с охлаждаща течност, която се разбърква така, че температурната разлика между всеки две точки от обема на течността да не е по-голяма от 0,2 градуса C. Температурата на течността не трябва да варира с повече от 0,5 градуса C от обявената от производителя стойност.

Течността в охлаждащата баня се поддържа на постоянно ниво и трябва да покрива цялата повърхност на епруветката с пробата, която се намира под обемната мярка на стъклото.

4.1.1.2. Циркулационен вид

Осигурява се постоянен приток на подходящ охлаждащ агент (течност), циркулиращ около епруветката. Температурата на течността не трябва да варира повече от +/- 0,5 градуса C от обявената от производителя стойност.

За охлаждащ агент се използва 33 % (v/v) воден разтвор на етан 1,2 диол (етилен гликол).

4.1.2. Термистор и придружаваща го електрическа верига

Термисторът е от типа на стъклената сонда с диаметър не по-голям от 1,80 +/- 0,2 mm и диаметър до 0,31 mm. Времевата константа трябва да е по-малка от 2 секунди, а стойността на v висока (вж. забележката). Постоянното работно напрежение, стойността на тока и топлинното разсейване трябва да бъдат такива, че температурата на термистора да не се повишава с повече от 0,0005 градуса C от тази на заобикалящата го среда (- 0,512 градуса C). Максимално допустимото отклонение в напрежението трябва да бъде 5,0 %.

Когато сондата е в работно положение в криоскопа, стъкленият й връх трябва да лежи по вертикалната ос на епруветката на разстояние 44,6 +/- 0,1 mm под отвора на съда (вж. фиг. 1). За поставянето на сондата в това положение се използва държател.

Забележка. b определя характеристиките на температурно съпротивление на термистора по формулата:

	dR		1		b
-		.		=	,
	dT		R		T2

където:

T е температурата по Келвин;

R - съпротивлението в омове при температура Т;

	dR		1
-		.		-	температурният коефициент;
	dT		R

b - константа, чиято стойност зависи от материала, от който е направен термисторът; в сега съществуващата практика се препоръчва стойност, по-голяма от 3000.

4.1.3. Измерване и отчитащо устройство

4.1.3.1. Принцип на измерване

Използваният уред работи на принципа на отчитане достигането на първото "плато" от кривата на точката на замръзване. Платото е този сектор от кривата, в който температурата остава постоянна в интервал +/- 0,002 градуса C в продължение на поне 20 секунди.

4.1.3.2. Ръчна операция

Съпротивлението на термистора се стабилизира чрез Мост на Уийтстон или друго подобно устройство. Използват се устойчиви резистори с високо качество с отклонение до p 10 % и температурен коефициент до 2 x 10-5 градуса С.

Променливият (стабилизиращият) резистор не може да се отклонява от линейността на тока по целия обхват на веригата с повече от 0,3 % от максималната му стойност.

Необходимо е да се предвиди средство за коригиране и нагласяване на резисторите за калибрирането им.

Измервателната скала се градуира на интервали не по-големи от 0,001градуса C.

4.1.3.3. Автоматична операция

Отчитащото устройство трябва да има точност, която да позволява отчитането на разлики в температурния интервал от 0 до - 1 градуса C най-малко 0,001градуса C.

Разделителната способност на отчитащото устройство и свързаната с него електрическа верига трябва да бъде такава, че разликата между последователните индикации на една и съща температура да не е по-голяма от 0,001 градуса C.

Линейността на тока по веригата трябва да бъде такава, че в нито една точка от интервала минус 0,400 градуса C - минус 0,600 градуса C допустимата грешка да не е по-голяма от +/- 0,001.

4.1.4. Бъркалка

За разбъркването на тест-порцията се използва бъркалка от индиферентен към съставките на млякото метал с диаметър между 1 и 1,5 mm.

Бъркалката се наглася за амплитудата на вибрации и се потапя вертикално, като долният й край се изравнява със стъкления връх на термисторната сонда. Допуска се отклонение 1,5 mm от това ниво.

Бъркалката вибрира странично с амплитуда повече от +/- 1,5 mm съгласно указанията на производителя, за да се осигури еднаква и равномерна температура на тест-порцията по време на определянето. Не се допуска контакт на бъркалката със сондата или стената на епруветката по време на нормалното разбъркване на пробата.

4.1.5.Устройство за предизвикване на замръзването

Това е устройство, което, приведено в работен режим, предизвиква незабавно замръзване на пробата, така че температурата на тест-порцията да намалява към точката на замръзване. За тази цел може да се използва бъркалката, като се увеличи амплитудата на вибрации за около една до две секунди, така че бъркалката да влезе в контакт със стената на епруветката с пробата.

4.1.6. Епруветки за пробата

Епруветките за пробата (вж. фиг. 1) трябва да са стъклени с дължина 50,8 +/- 0,1 mm, външен диаметър 16,0 +/- 0,1 mm и вътрешен диаметър 13,5 +/- 0,1 mm. Допустимата разлика в дебелината на стените е не повече от 0,1 mm. Епруветките трябва да са означени с обемна мярка 29,8 mm под края (21 mm над основата на съда) за обозначаване обем на пробата 2,5 +/- 0,1 ml.

4.1.7. Електрическо захранване

Напрежението на захранващия източник се стабилизира в уреда или чрез външен стабилизатор така, че флуктуациите да не превишават 1 % от номиналната стойност при променливост на тока в мрежата +/- 6 %.

4.2. Аналитични везни

4.3. Мерителна колба с единична обемна мярка и вместимост 1000 ml, клас А

4.4. Сушилня с добра вентилация, която поддържа температура от 130 +/- 1 градуса C, или електрическа пещ с вентилация, която поддържа температура от 300 +/- 25 градуса C

4.5. Ексикатор

5. Реактиви

5.1. Дестилирана в боросиликатно стъкло вода, нагрята до кипене и охладена до температура 20 +/- 2 градуса C, поставена в колба, снабдена с епруветка за абсорбиране на въглеродния двуокис

5.2. Натриев хлорид, ч.з.а., фино смлян и изсушен в пещ при температура 300 +/- 25градуса C в продължение на 5 часа или в сушилня при температура 130 +/- 1градуса C за не по-малко от 24 часа и охладен в ексикатор до стайна температура

5.3. Приготвяне на стандартни разтвори

Съответното количество сух натриев хлорид (т. 5.2) (вж. таблицата) се претегля в тегловно стъкло. Разтваря се в дестилирана вода (т. 5.1) и се прехвърля количествено в мерителна колба с единична обемна мярка от 1000 ml, след което се разрежда с водата до обемната мярка при температура 20 +/- 2 градуса C.

Разтворът се съхранява при температура 5градуса C в добре затворени полиетиленови шишета с вместимост до 250 ml най-много два месеца.

Точка на замръзване на разтворите на натриев хлорид, приготвени при температура 20 градуса С

g NaCl/l	градуса С
6,859	- 0,408
7,818	- 0,464
8,149	- 0,483
8,314	- 0,492
8,480	- 0,502
8,646	- 0,512
8,811	- 0,521
8,977	- 0,531
9,143	- 0,541
10,155	- 0,600

Преди употреба полиетиленовото шише със стандартния разтвор се обръща и разклаща неколкократно и внимателно с кръгообразни движения до хомогенното смесване на съдържанието. Разтворът не трябва да се разбърква енергично, за да се избегне образуването на въздушни мехурчета.

Пробите със стандартния разтвор се прехвърлят от шишето чрез разливане в чиста и суха бехерова чаша. Не се допуска прехвърлянето на разтвора чрез пипети.

Не се допуска използването на разтвори, съхранявани в шишета, които са напълнени до една четвърт от обема им, както и употребата на разтвори, които са престояли повече от два месеца, ако не са били третирани с фунгициден препарат (например разтвор на тиомерзал, 10 g/l).

6. Калибриране на криоскопа

Криоскопът трябва да бъде конструиран по начин, който не позволява отклонение на температурата на околната среда от температурата на калибриране повече от 1 градуса C. Уредът не трябва да се излага на слънчева светлина, течение или стайна температура, по-висока от 27 градуса C.

Преди началото на анализа се проверява съответствието на работното състояние на криоскопа с указанията на производителя. Уредът се включва към захранващото устройство най-малко 12 часа преди започването на калибрирането в зависимост от изискванията на техническата спецификация. Проверяват се положението на сондата, амплитудата на трептенията и температурата на охлаждащия агент.

Избират се двата стандартни разтвора (вж. таблицата) с най-точно приближение до очакваната точка на замръзване на пробите мляко за изследване. Разликата между точките на замръзване на разтворите трябва да е не по-малка от - 0,100 градуса C. (В някои от сега предлаганите модели на криоскопа е заложено свързаната с термистора верига да се уравновесява при определена специфична стойност на точката на замръзване в обхвата на измерване на уреда. В този случай използването на стандартен разтвор с точка на замръзване като тази на калибриращите разтвори улеснява самото калибриране, като производителят задължително обявява посочената стойност.)

2,5 +/- 0,1 ml от даден стандартен разтвор се отпипетира в чиста и суха епруветка с пробата за изследване, след което се поставя в работещия криоскоп.

Забележка. Епруветките с пробите за калибриране трябва да бъдат от същото стъкло както това на епруветките за изследване на пробите мляко и да бъдат изплакнати и промити с деминерализирана вода едновременно с тях. Температурата на стандартните разтвори трябва да е сходна с тази на пробите с мляко.

Калибрационните контроли се нагласяват според указанията на производителя, докато отчетените от криоскопа резултати се изравнят с точката на замръзване на стандартния разтвор, като се редуват стандартните разтвори. Процедурата се повтаря докато две последователни отчитания за всеки стандартен разтвор покажат точната стойност на точката му на замръзване без допълнителна корекция на контролите. Криоскопът се привежда в работен режим и се подготвя да отчита директно точката на замръзване на пробата с мляко без допълнителни корекции.

7. Подготовка на пробите за изследване

7.1. Пробите се съхраняват при температура от 0 до 5 градуса C, когато са в голямо количество и не могат да бъдат изследвани същия ден.

7.2. От пробата се отстраняват всички видими чужди тела или твърди маслени частици, ако се налага чрез филтриране, в чист и сух съд. Съдържанието се разбърква добре. Използваният филтър трябва да бъде от индиферентен към млякото материал, който работи при лабораторна температура.

7.3. Млякото може да се изследва при температурата, при която се съхранява (между 0 и 5 градуса C) или след уеднаквяване с лабораторната температура преди започване на анализа. Температурата на стандартните разтвори и тази на пробите мляко обаче трябва да бъдат еднакви.

7.4. Едновременно с определяне точката на замръзване се определя и титруемата киселинност на млякото. Когато титруемата киселинност превишава 0,18 g млечна киселина на 100 ml (20 градуса Т) за краве мляко или до 26 градуса Т за овче мляко, млякото не може да се изследва.

7.5. Преди започване на анализа произведеното по UHT технология мляко и стерилизираното мляко трябва да престоят в отворен контейнер поне 20 минути.

8. Процедура

8.1. Предварителни проверки

Проверява се нивото и температурата на охлаждащия агент дали съответстват на указанията на производителя и ако е необходимо - дали сондата на термистора е в празна епруветка във ваната за проби. Криоскопът се привежда в работен режим, проверява се дали охлаждащата течност се разбърква или циркулира правилно. След като уредът е работил най-малко 12 часа, се проверява температурата на охлаждащата течност, положението и амплитудата на вибрации на бъркалката.

8.2. Рутинна проверка на калибрирането

Преди всяко изследване се измерва точката на замръзване на стандартния разтвор на натриев хлорид (например разтвор с точка на замръзване минус 0,512 градуса C), докато разликата между две последователни определяния стане по-малка от 0,001 градуса C. Ако тази стойност се различава с повече от 0,002 градуса C от точката на замръзване на стандартния разтвор, криоскопът се калибрира отново, както е описано в т. 6.

Ако уредът се използва продължително време, трябва да се извърши рутинна проверка на калибрирането най-малко един път на час, като се спазват указанията на производителя.

8.3. Определяне точката на замръзване на млякото

Стъклото с пробата мляко се обръща и разклаща внимателно с кръгообразни движения до хомогенното смесване на съдържанието. Млякото не трябва да се разбърква енергично, за да се избегне образуването на мехурчета. 2,5 +/- 0,1 ml мляко се прехвърлят в чиста и суха епруветка с пипета. Излишното количество се отстранява чрез пипета. Сондата и бъркалката трябва да бъдат чисти и сухи. Когато е необходимо, се забърсват от долу на горе с мека и чиста кърпа без влакна.

Епруветката с пробата мляко се поставя в калибрирания криоскоп съгласно указанията на производителя. Млякото се охлажда, замръзването започва при температура, определена от производителя с разлика от 0,1 градуса C. (На някои автоматични уреди тази температура се отчита на дигиталното четящо устройство. Точността на ръчните уреди се определя след проверка, че замръзването започва, когато стрелката или визирната линия на галванометъра съвпадне със съответното обозначение.)

Ако по някаква причина замръзването започне след или преди достигането на определените температурни граници, епруветката се отстранява и изследването се повтаря с нова тест-порция. Ако и при повторната проба млякото замръзне преди определената температура, допълнителна тест-порция се загрява до 45 градуса C в продължение на 5 минути до разтопяване на кристализиралата мазнина. Пробата се охлажда отново до температурата на изследване и се изследва. След предизвикване на замръзването температурата на млякото се повишава бързо до временно константна величина, след което отново намалява. Точката на замръзване съответства на най-високата температура, постигната през това време. Регистрира се най-високата стойност.

Забележка. Времето, през което температурата остава постоянна, и времето между предизвикването на замръзването и достигането на най-високата температура е различно за различните проби и значително по-кратко за водата и стандартните разтвори на натриев хлорид в сравнение с млякото. Затова е необходимо да се запише най-високата температура.

След измерването епруветката се изважда, изплаква с вода, а термисторната сонда и бъркалката се подсушават отдолу нагоре с мека и чиста кърпа без власинки. След това се извършва паралелно определяне върху друга част от пробата с мляко.

Ако разликата между получените точки на замръзване е по-голяма от стойността на повторяемост (0,004 градуса C), се прави паралелно определяне върху друга част от пробата. Ако съответствието между двете определяния е с точност до 0,004 градуса C, съответните стойности се записват и използват за изчисление на крайния резултат.

8.4.Охлаждане на сондата

След използване на уреда във ваната се поставя празна епруветка и главата на термистора се сваля, за да се поддържа сондата охладена. (В някои модели на криоскопа тази операция е невъзможна. Затова е много важно сондата да е охладена правилно преди започване на измерванията - например чрез празни определяния до регистрирането на стабилни отчитания.)

9. Представяне на резултатите

9.1. Изчисление

Ако след рутинната проверка калибрирането бъде потвърдено, се изчислява средната стойност на получените допустими точки на замръзване и се закръглява до третия десетичен знак.

Ако сумата от две допустими паралелни определяния е нечетно число, средната стойност се закръглява до най-близкото четно число, както е показано в примера:

Точка на	Паралелни	Средна
замръзване (градуса C)	стойности	стойност
- 0,544	- 0,545	- 0,544
- 0,545	- 0,546	- 0,546

9.2. Точност

9.2.1. Повторяемост (r): 0,004 градуса C.

9.2.2. Възпроизводимост (R): 0,006 градуса C.

Приложение № 6 към чл. 20, ал. 4

Изброяване на общ брой микроорганизми при температура 30 градуса С

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за изброяване на микроорганизмите чрез метода за преброяване на колониите при температура 30 градуса C. Прилага се за суровото и пастьоризирано мляко, както и за произведеното по UHT технология и стерилизирано мляко, предварително инкубирано при температура 30 градуса C в продължение на 15 дни.

2. Определение

Под "микроорганизми" се разбира микроорганизми, способни да образуват броими колонии при аеробно култивиране при описаните условия.

3. Принцип

Определен обем от пробата с мляко за изследване се смесва с хранителна среда в петриеви панички и се инкубира при температура 30 градуса C в продължение на 72 часа. Определя се броят на порасналите колонии и се изчислява общият брой на микроорганизмите в 1 ml сурово или пастьоризирано мляко или в 0,1 ml предварително инкубирано, произведено по UHT технология или стерилизирано мляко.

4. Апаратура и лабораторна стъклария

Стандартно лабораторно оборудване:

4.1. Апаратура

4.1.1. Стерилизатор на горещ въздух при температура от 170 до 175 градуса C.

4.1.2. Автоклав, работещ при температура 121 +/- 1 градуса C.

4.1.3. Инкубатор (термостат), поддържащ температура от 30 +/- 1 градуса C в цялото работно пространство.

4.1.4. pH-метър с компенсация на температурата и точност +/- 0,1 pH.

4.1.5. Водна баня с регулатор на температурата при 45 +/- 1 градуса C.

4.1.6. Лупа с увеличение 2-4x.

4.1.7. Лупа с увеличение 8-10x.

4.1.8. Броителна камера/регистриращ броящ.

4.1.9. Миксер за разбъркване на 1 ml от пробата или десетократно разреждане с 9 ml разредител, работещ на принципа на ексцентричната ротация.

4.2. Лабораторна стъклария

4.2.1. Епруветки с подходящи запушалки и пространство за разбъркване и достатъчна вместимост за 10 ml основно разреждане или други десетократни разреждания.

4.2.2. Колби с вместимост от 150 до 250 ml или епруветки с приблизителна вместимост 20 ml за посяване на хранителната среда.

4.2.3. Пипети (с памучни запушалки) от стъкло или стерилен синтетичен материал със здрав край, с номинална вместимост 1 ml и отвор с диаметър 1,75 до 3 mm.

4.2.4. Петриеви панички от безцветно прозрачно стъкло или стерилен синтетичен материал, с вътрешен диаметър на долната паничка от около 90 - 100 mm и дълбочина най-малко 10 mm. Дъното трябва да бъде гладко, за да не пречи на точното преброяване на колониите.

4.2.5. Стерилизация на лабораторната стъклария.

Лабораторната стъклария се стерилизира по един от следните начини:

а) в сушилня на горещ въздух при температура от 170 до 175 градуса C за не по-малко от един час (т. 4.1.1);

б) в автоклав (т. 4.2.1) при температура 121 +/- 1 градуса C за не по-малко от 20 мин.

При стерилизация в автоклав трябва да се осигури добър достъп на парата до стъкларията. Така например, ако оборудването се стерилизира в контейнери, те не трябва да бъдат плътно затворени, а колбите трябва да са с отворени капаци.

Стерилизираната в автоклав лабораторна стъклария се изсушава чрез вентилиране на парата.

Пипетите се стерилизират в сушилня на горещ въздух (т. 4.1.1).

5. Хранителна среда - агар за изброяване на микроорганизмите

5.1. Състав на средата: дрождев екстракт - 2,5 g; триптон - 5,0 g; глюкоза D (+) или декстроза - 1,0 g; обезмаслено мляко на прах - 1,0 g; агар-агар - 10 до 15 g в зависимост от желиращите свойства на използвания агар; вода - 1000 ml.

Обезмасленото мляко на прах трябва да бъде свободно от инхибитори, което се определя чрез сравнителни изследвания, ползващи обезмаслено мляко на прах, за което се знае, че е свободно от инхибитори.

Приготвяне на хранителната среда

Съставките се суспендират и разтварят във водата в следната последователност: дрождев екстракт, триптон, глюкоза, обезмасленото мляко на прах. Нагряването на суспензията улеснява манипулацията. Прибавя се агар-агарът и се нагрява до кипене, като непрекъснато се разбърква до пълното му разтваряне или се разтваря на пара в продължение на 30 мин.

При необходимост се филтрира през филтърна

хартия.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява активната киселинност на средата и при необходимост се коригира, така че след стерилизацията да е равна на 6,9 +/- 0,1, като се използва разтвор (не по-малко от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

5.2. Разпределение, стерилизация и съхранение на хранителната среда

Средата (т. 5.1) се разлива в количества от 100 - 150 ml в колби или 12 - 15 ml в епруветки (т. 4.2.2), след което съдовете се затварят със запушалки и се стерилизират в автоклав (т. 4.1.2) при температура 121 +/- 1 градуса C за 15 мин. Проверява се pH на средата. Ако не се използва веднага, хранителната среда се съхранява на тъмно при температура между 1 и 5 градуса C най-много един месец, след като е била приготвена.

5.3. Готова суха хранителна среда

Хранителната среда (т. 5.1) може да бъде приготвена и от готова суха среда, предлагана на пазара, като се спазват указанията на производителя. Ако средата не съдържа в състава си обезмаслено мляко на прах, то се прибавя непосредствено преди разтварянето.

Коригира се pH на 6,9 +/- 0,1 при температура 25 градуса C, както е описано в т. 5.1, след което средата се поставя в съответните съдове, стерилизира се и се съхранява по указаните в т. 5.2 начини.

6. Разредители

6.1. Пептон-солов разтвор

Състав: пептон - 1,0 g; натриев хлорид (NaCl) - 8,5 g; вода - 1000 ml.

Приготвяне

Съставките се разтварят във вода. При необходимост така полученият разтвор се нагрява.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява активната киселинност на разредителя и при необходимост се коригира, така че след стерилизацията да е равна на 7,0 +/- 1 градуса C при температура 25 градуса C, като се използва разтвор (не по-малко от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

6.2. Разпределение, стерилизация и съхранение на разредителя

Разредителят (т. 6.1) се пресипва в епруветки (т. 4.2.1) в такива количества, че след стерилизацията обемът на разредителя да е равен на 9,0 +/- 0,2 ml, след което епруветките се затварят със запушалки и се стерилизират в автоклав (т. 4.1.2) при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 мин.

Проверява се pH на разредителя.

Ако не се използва веднага, разредителят се съхранява на тъмно при температура между 1 и 5 градуса C най-много един месец, след като е бил приготвен.

6.3. Готов сух разредител

Разредителят (т. 6.1) може да бъде приготвен и от готови таблети или прах, предлагани на пазара, като се спазват указанията на производителя. Коригира се pH на разредителя, както е описано в т. 6.1, и се поставя в съответните съдове, стерилизира се и се съхранява по указаните в т. 6.2 начини.

7. Процедура

7.1. Разтапяне на хранителната среда

Необходимото количество среда се разтапя бързо и темперира на водна баня (т. 4.1.5) до 45 +/- 1 градуса C преди началото на микробиологичното изследване.

7.2. Подготовка на пробата мляко

Пробата мляко се размесва добре, за да се осигури най-равномерно разпределение на микроорганизмите чрез бързо 25-кратно обръщане на контейнера с пробата, като се избягва образуването на пяна или ако има такава, тя се оставя да се диспергира. Времето между смесването на пробата и отпипетирането на тест-порцията не трябва да превишава три минути.

7.3. Приготвяне на основно разреждане (10-1) сурово и пастьоризирано мляко

1 ml от пробата със сурово или пастьоризирано мляко (т. 7.2) се прехвърля със стерилна пипета (т. 4.2.3) в 9 ml разредител (т. 6.1), като се внимава пипетата и разредителят да не влизат в контакт. Температурата на разредителя трябва да бъде приблизително равна на температурата на пробата с мляко. За окончателното му получаване основното разреждане внимателно се смесва с миксер (т. 4.1.9) за около 5 - 10 секунди.

7.4. Приготвяне на следващи десетократни разреждания (сурово и пастьоризирано мляко)

За получаване на десетократни разреждания 1 ml от основното разреждане (т. 7.3) се прехвърля чрез стерилна пипета (т. 4.2.3) в 9 ml от разредителя (т. 6.1), като се спазват указанията, дадени в т. 7.3. Получава се разреждане 10-2.

Приготвянето на допълнителни десетократни разреждания се извършва чрез повторение на същите манипулации до получаване на съответния очакван брой микроорганизми (т. 8.1.1).

7.5. Инокулиране на петриевите панички

7.5.1. Сурово мляко: 1 ml от пробата и/или съответното десетократно разреждане се прехвърлят в петриева паничка (т. 4.2.4) със стерилна пипета (т. 4.2.3). Изследват се най-малко две разреждания. Приготвя се по едно петри от всяко десетократно разреждане (т. 8.1.1).

7.5.2. Пастьоризирано мляко: 1 ml от пробата и/или съответното десетократно разреждане се прехвърлят в петриева паничка (т. 4.2.4) със стерилна пипета (т. 4.2.3). Изследват се най-малко две разреждания. Приготвя се по едно петри от всяко десетократно разреждане (т. 8.1.1).

7.5.3. Произведено по UHT технология и стерилизирано мляко (изследва се след култивиране в продължение на 15 дни при температура 30 градуса C): 0,1 ml от пробата с мляко (т. 7.2) се прехвърля в петриева паничка (т. 4.2.4) със стерилна пипета (т. 4.2.3). Приготвят се две петри.

7.6. Разливане в петриеви панички

Върху посевките във всяка петриева паничка се разливат от 15 до 18 ml от средата (т. 7.1). Непосредствено след разливането й хранителната среда се размесва с инокулума в петрито чрез кръгообразни движения, за да се получи равномерно разсейване на колониите след инкубация.

Времето между окончателното приготвяне на пробата мляко и смесването със средата - в зависимост от вида мляко, тест-порцията или разреждането, не трябва да превишава 15 минути.

Петритата се поставят на чиста, хладна хоризонтална повърхност до втвърдяване на съдържанието.

7.7. Инкубиране на петриевите панички

Петритата се поставят в инкубатор (т. 4.1.3). Култивират се обърнати не повече от шест една върху друга, разделени помежду си и от стените и тавана на инкубатора при температура 30 +/- 1 градуса C в продължение на 72 +/- 2 часа.

7.8. Изброяване на колониите

Изброяват се колониите в петрита, които съдържат по-малко от 300 колонии.

Петритата се изследват на непряка светлина. За улесняване на изброяването може да се ползва лупа (т. 4.1.6) и/или броителна камера (т. 4.1.8). Специално внимание трябва да се обърне на частиците от утаечни вещества в петрита, които не трябва да се бъркат с колониите с формата на глава на топлийка (точковидни колонии). За различаване на колониите от чуждите тела съмнителните обекти се изследват внимателно, при необходимост с помощта на лупа с по-голямо увеличение (т. 4.1.7).

Разлети или слети колонии се броят като една. Ако разливането е обхванало по-малко от една четвърт от петриевата паничка, се изброява броят на колониите в незасегната повърхност на петрито, след което се изчислява съответното число за цялото петри. Ако е покрита по-голяма част от една четвърт на петрито, то се отстранява.

8. Изчисляване на резултатите

8.1. Прясно и пастьоризирано мляко

8.1.1. Използват се резултатите от всички петриеви панички, съдържащи между 10 и 300 колонии (вж. т. 8.1.3 и 8.1.4).

8.1.2. Броят на микроорганизмите (бактериалното число) на 1 ml сурово или пастьоризирано мляко се определя по формулата:

		S С
N	=	,
		(n1 + 0,1n2) d

където:

S C е сумата от колониите, изброени съгласно т. 8.1.1;

(n1 + 0,1 n2) d - обемът на посятата проба, в която:

n1 - броят на петрита, отчетени от първото разреждане;

n2 - броят на петрита, отчетени от второто разреждане;

d - факторът на разреждане, от който са получени първите резултати.

Резултатът се обработва допълнително до две значими числа. Ако числото, което трябва да се закръгли, е 5, закръглява се броят вляво от 5, за да се получи четно число.

8.1.3. Ако резултатите показват само брой на колониите, по-малък от 10, броят на микроорганизмите на милилитър се отчита като "по-малко от 10 x d на ml" (d е реципрочната стойност на фактора на най-ниското разреждане).

8.1.4. Ако резултатите отчитат само брой на колониите, по-голям от 300, при които изброяването е все пак възможно, се прави изчисление на определения брой и се умножава по реципрочната стойност на фактора за разреждане. Резултатът се записва като "Отчетен брой микроорганизми на милилитър".

8.2. Произведено по UHT мляко и стерилизирано мляко

Посевки с повече от 10 колонии при 0,1 ml се приема, че не отговарят на изискванията.

Приложение № 7 към чл. 20, ал. 4

Изброяване на соматичните клетки

Процедурата определя следните два референтни метода за определяне общия брой на соматичните клетки в суровото мляко:

I. Микроскопски метод;

II. Флуоро-опти-електронен метод (Фоссоматик).

I. Микроскопски метод

1. Приложение

С референтния метод се определя общият брой на соматичните клетки в суровото мляко.

Процедурата определя метода за изброяване на клетъчните елементи в проба мляко за калибриране и проверка на точността на флуоро-опти-електронния метод (вж. т. II. 1).

2. Определение - соматични клетки са мононуклеарни левкоцити, полиморфонуклеарни левкоцити (неутрофилни, ацидофилни), мононуклеарни клетки (лимфоцити и моноцити) и епителните клетки, чиито ядра се различават ясно при оцветяване с метиленово синьо.

3.Принцип - 0,01 ml се поставя върху предметно стъкло с размери 1 cm2. Натривката се изсушава и оцветява. Изброяването се извършва с микроскоп. Броят на соматичните клетки, отчетен в даден сектор, се умножава по фактора на микроскопа, за да даде броя на клетъчните елементи в 1ml.

4. Реактиви

Използват се реактиви ч.а.с

Багрило - състав: метиленово синьо - 0,6 g; етанол (95 % V/V) - 54,0 ml; 1,1,1-трихлороетан или тетрахлороетан - 40,0 ml; ледена оцетна киселина - 6,0 ml.

Внимание! Тетрахлороетанът е отровен. Приготвянето на разтвор от него и употребата му трябва да се извършва в лабораторна камина.

Приготвяне

Посочените количества етанол и 1,1,1-трихлороетан или тетрахлороетан се разтварят в стъкло. Съдържанието се нагрява на водна баня до 60 - 70 градуса C. Добавя се метиленово синьо. Внимателно се разбърква и охлажда в хладилник до 4 градуса C за 12 до 24 часа, след което се прибавя ледената оцетна киселина. Багрилото се филтрира през филтър с порьозност от 10 до 12 микрона или по-малко. Съхранява се в плътно затворено стъкло. При образуването на седимент разтворът се филтрира отново преди употреба.

5. Апаратура и лабораторна стъклария

5.1. Микроскоп с увеличение от x 500 до x 1000.

5.2. Микропипета, 0,01 ml и точност +/- 2 % или по-голяма.

5.3. Индуктивна плака, с маркирана площ 20 mm x 5 mm или шаблон и подложка с маркирана площ за натривката 20 mm x 5 mm.

5.4. Нивелирана нагревателна плоча (30 - 50 градуса C) за изсушаване на натривките.

5.5. Сушилня за натривки

5.6. Водна баня, работеща при температура 30 - 40 градуса C, за нагряване на пробата с мляко.

5.7. Обект-микрометър с деления от 0,01 mm.

6. Процедура

6.1. Проба

Пробата с мляко се изследва до шест часа след вземането й. По време на съхранението температурата й не трябва да надвишава 6 градуса C, като се внимава да не замръзне.

6.2. Лабораторна подготовка на пробата

Пробата се нагрява във водна баня (т. 5.6) до температура 30 - 40 градуса C, след което внимателно се размесва и се охлажда до температурата, при която е била калибрирана с микропипета (т. 5.2) - например 20 градуса C.

6.3. Предварителна обработка на предметните стъкла

Предметните стъкла (т. 5.3) се почистват с етанол, подсушават се с чиста хартия, опламеняват се и се охлаждат. За да не се напрашат, стъклата се поставят за съхранение в кутии.

6.4. Подготовка на натривката

0,01 ml от предварително подготвената проба се всмуква с микропипета (т. 5.2), чиито външни стени се почистват внимателно от млякото. Пипетата се полага на предметното стъкло (т. 5.3), като първо се издухва фиксираното количество на площ с размери 20 mm x 5 mm и след това се разстила равномерно по маркираната площ. Натривката се оставя на нивелираната нагревателна плоча до пълното й изсушаване.

За всяка проба мляко се подготвят и изследват най-малко две натривки.

6.5. Оцветяване на натривките

Натривките се потапят в багрилния разтвор (т. 4) за 10 минути. Изцеждат се и се изсушават при необходимост в сушилня за натривки (т. 5.5), след което се потапят в питейна вода до пълното отстраняване на неабсорбираното багрило. Изсушават се отново и се съхраняват на защитено от прах място.

6.6. Калибриране на зрителното поле на микроскопа

Диаметърът на зрителното поле се определя чрез обект-микрометър (т. 5.7) в зависимост от избраното увеличение на микроскопа (x 500 до x 1000).

7. Изброяване и изчисляване на резултата

7.1. Изброяване на клетъчните елементи

За целта се използва микроскоп (т. 5.1). Преброяват се всички ядрени клетки. Струпванията от клетки, без ядра, малките клетки (с големина на ядрото под 4 m) и частиците с клетъчен характер не се броят. Броят се мононуклеарни левкоцити, полиморфонуклеарни левкоцити (неутрофилни, ацидофилни), мононуклеарни клетки (лимфоцити и моноцити) и епителните клетки.

7.2. Минимален брой клетки, подлежащ на изброяване

Тъй като определянето броя на соматични клетки чрез микроскоп може да се използва също така и за стандартизиране на автоматичното и механизираното броене, коефициентът на вариация на резултатите от идентични проби не може да превишава коефициента на вариация на електронните устройства. Коефициентът на вариация за проба с мляко, съдържаща 400 000 - 600 000 клетки/ml, не трябва да надвишава 5 %.

За да удовлетвори критерия за повторяемост, броят на соматичните клетки, подлежащ на отчитане за всяка проба мляко, трябва да бъде поне равен на 400 съгласно разпределението на Поасон.

Разпределение на Поасон:

M = V = S1,

където:

M е средната стойност;

V - дисперсията на разпределението;

S - стандартното отклонение.

Коефициентът на вариация e:

		s x 100 %				100 %				100 %
CV	=		или	CV	=		или	CV	=
		M				s				VM

M - (средната стойност), която обозначава отчетения брой на клетъчните елементи (т. е. 400 за CV = 5 %).

7.3. Определяне фактора на микроскопа

При 0,01 ml мляко факторът на микроскопа се определя съгласно т. 7.3.1 или 7.3.2.

7.3.1. Изброяване на ивици по натривката

Дължината на всяка ивица, подлежаща на отчитане, е 5 mm. Широчината й съответства на диаметъра на зрителното поле, определен с обект-микрометъра (т. 5.7).

		20.100
Фактор на микроскопа	=	,
		d b

където:

100 е броят на ивиците на микрометъра;

20 - броят на зрителните полета;

d - диаметърът на зрителното поле в милиметри, определен с обект-микрометър (т. 5.7);

b - броят на изцяло отчетените ивици.

7.3.2. Изброяване на зрителните полета в средната третина на натривката или с растер

		20.5.100		12732
Фактор на микроскопа	=		=	,
		p.d2.s		d2.s
		4

където:

d e диаметърът на зрителното поле, определен с обект-микрометър (т. 5.7);

s - броят на полетата;

или

		x.y
Фактор на микроскопа	=	,
		p.r2

където:

х e площта на натривката (обикновено 100 mm2);

у - 100 (умножава се при пресмятането на броя на соматичните клетки в 1 ml проба);

r - радиусът на зрителното поле в mm (т. 5.7);

p - 3,1416.

7.4. Изчисляване на клетъчното съдържание

Клетъчното съдържание в 1 ml мляко се получава, като отчетеният брой на соматичните клетки (т. 7.1 и 7.2) се умножи по фактора на микроскопа.

7.5. Точност

Коефициентът на вариация (вж. т. 7.2) не трябва да надвишава 5 %.

II. Флуоро-опти-електронен метод

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод, който след съответното калибриране (вж. т. I.1) може да се използва за определяне броя на соматичните клетки в суровото мляко - в третирани или нетретирани с химически консерванти проби.

2. Определение

За целите на този метод соматичните клетки се определят като частици с минимална интензивност на флуоресценция чрез оцветяването на ДНК в ядрото им.

3. Принцип

Част от пробата (например 0,2 ml) се размесва добре с буферен и флуоресциращ разтвор. Част от сместа се наслоява върху въртящ се диск, който служи като масичка на микроскопа.

Всяка клетка произвежда електрически импулс, който се усилва и записва. Броят на соматичните клетки се отчита в хиляди на милилитър.

4. Реактиви

Реактивите трябва да бъдат ч.а.с химически субстанции. Използваната вода е дестилирана или дейонизирана с равностойна чистота.

4.1. Буферен разтвор

Състав: калиево-водороден фталат - 51,0 g; калиева основа - 13,75 g; полиетиленгликол - моно - p(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фенил-етер (например тритон х-100), 1 % (v/v) - 10 ml; pH - 5,7 до 5,9; разрежда се с вода до обем 10 000 ml.

Приготвяне на разтвора:

Смесват се отделните съставки. Херметически затворен, разтворът е годен за употреба до седем дни от приготвянето му.

4.2. Флуоресциращ разтвор (основен разтвор)

Състав: етид - бромид - 1,0 g; разрежда с вода до обем 1000 ml.

Приготвяне на разтвора

Етид - бромидът се разтваря във вода. Херметически затворен в светлоустойчиво стъкло, разтворът е годен за употреба до два месеца от приготвянето му.

4.3. Флуоресциращ (работен) разтвор - 20 ml от основния разтвор (т. 4.2) се смесват с буфера в обем 1000 ml. Работният разтвор е годен за употреба до седем дни от приготвянето му.

4.4. Почистващ разтвор

Състав: буферен разтвор (т. 4.1) - 10 ml; полиетиленгликол - моно - p-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фенил- етер (например тритон x-100), 1 % (v/v) - 10 ml; амоняк, 25 % (v/v) - 25 ml; разрежда се с вода в обем 10 000 ml.

Приготвяне на разтвора

Смесват се отделните съставки. Разтворът е годен за употреба до 30 дни след приготвянето му.

Забележка. Съставът на реагентите може да варира в зависимост от използваната система на изброяване. Следват се точно инструкциите на производителя.

5. Апаратура и лабораторна стъклария

5.1. Отчитащо устройство (брояч), което работи на принципа на оптичната флуоресценция.

Забележка. Преди употреба устройството се калибрира. Определят се корелацията между обема на частиците, подлежащи на изброяване, и граничният праг, над който се извършва отчитането. Калибрирането на апаратурата се осъществява в съответствие с указанията на фирмата-производител, като се използват проби, чието клетъчно съдържание е предварително установено чрез микроскопския метод (т. I).

5.2. Водна баня с циркулация, работеща при температура 40 +/- 1 градуса C.

5.3. Епруветка с подходяща херметизираща запушалка и приблизителен обем 15 ml.

6. Проба с мляко

6.1. Пробата се съхранява в епруветка (т. 5.3) при температура до 6 градуса C. Ако изброяването се извърши на неконсервирано мляко в рамките на 24 часа след издояването със стар модел фоссоматик 90 или 215, може да се получат нереални резултати.

6.2. Консервиране

Консервирането с химикали се извършва във възможно най-кратък срок до 24 часа след вземането на пробата.

6.2.1. Пробата се консервира със следните химически консерванти:

а) ортоборна киселина - крайната концентрация на ортоборната киселина не трябва да превишава 0,6 g/100 ml; така консервирана, пробата може да се съхранява в продължение на още 24 часа при температура от 6 до 12 градуса C;

б) калиев бихромат - крайната концентрация на калиевия бихромат не трябва да превишава 0,2 g/100 ml; така консервирана, пробата може да се съхранява в продължение на още 72 часа при температура от 6 до 12 градуса C;

в) натриев азид - пробата може да се консервира с натриев азид до получаването на крайна концентрация от 0,024 g/100 ml, ако непосредствено след вземането й е била охладена до 4 - 6 градуса C (6 до 12 градуса C) и подложена на изследване за броя на клетъчните елементи и общ брой микроорганизми в нея до 48 часа от същия момент;

г) бронопол - пробата може да се консервира с бронопол до получаването на крайна концентрация от 0,05 g/100 ml, ако непосредствено след вземането й е била охладена до температура 6 - 12 градуса C и е подложена на изследване за броя на клетъчните елементи до 72 часа от същия момент.

6.2.2. Третирана вече с ортоборна киселина, пробата може да бъде допълнително консервирана до 48 часа с калиев дихромат.

Забележка. За третираните с калиев дихромат проби трябва да се спазват определените условия за изхвърляне на отпадъчните флуиди.

7. Процедура

7.1. Предварителна обработка на пробите

След издояване млякото, определено за изследване, се съхранява при температура от 2 до 6 градуса C най-малко 24 часа. Не се препоръчва отчитането на пробите за брой на соматичните клетки в деня на издояване без предварителна обработка, защото това може да доведе до занижаване на резултатите. Ако подобно изследване все пак се налага, пробата се третира с калиев дихромат най-малко 3 часа (вж. т. 6.2.1).

7.2. Подготовка за преброяване

Предварително третираната проба (вж. т. 7.1) или необработена все още проба, която е престояла поне един ден, се нагрява във водна баня (т. 5.2) до температура от около 40 градуса C. Съхранява се при стайна температура до началото на изследването.

7.3. Преброяване

Преброяването се извършва с помощта на отчитащото устройство (брояч) (т. 5.1) до 15 мин след приключване на нагряването (вж. т. 7.2). Непосредствено преди изследването пробата се разбърква добре до получаването на хомогенно разпределение на соматичните клетки в нея.

Допълнителното разреждане и подготовка на пробата се извършва автоматично в устройството.

8. Точност на определянето

Няма определени числови стойности, удовлетворяващи критериите за повторяемост (r) и възпроизводимост (R), от международно признати съвместни опити. Регистрираните на национално ниво данни позволяват следните оценки:

Брой на соматичните клетки между 400 000 и 500 000/ml:

а) стандартно отклонение на повторяемостта:

sr = 20 000 клетки/ml

(равно на коефициент на вариация 5 - 4 %);

б) стандартно отклонение на възпроизводимостта:

sR = 40 000 клетки/ml

(равно на коефициент на вариация 10 - 8 %).

9. Проверка на точността на определяне

Точността на определяне се проверява въз основа на проби с известно клетъчно съдържание, определено чрез отчитане броя на соматичните клетки, проведено в национална референтна лаборатория чрез микроскопския метод.

Приложение № 8 към чл. 20, ал. 4

Доказване на антибиотици и сулфонамиди

Приложение

Процедурата определя референтния метод за доказване на антибиотици и сулфонамиди в суровото и топлиннообработеното мляко.

Референтният метод включва:

I. Метод за качествено доказване наличието на антибиотици и сулфонамиди

Метод за първоначално селектиране на пробите с мляко, които съдържат антибиотици, включващи сулфонамиди, който представлява част от серия сходни методи, използващи Bacillus stearоthermophilus var. calidolactis, щам ATСC 10149 като основен тест-организъм. Методът е представителен за серията от изследвания.

II. Метод за потвърждаване и идентификация на пеницилина

Методът се използва за потвърждаване резултатите от метода за качествено доказване на пеницилина и определяне на концентрацията му.

I. Метод за качествено доказване

1. Приложение

Методът определя начините за качествено доказване на антибиотици и сулфонамиди в суровото и топлиннообработеното мляко, превишаващи нормите, посочени в таблицата:

Доловими концентрации на антибиотици и сулфонамиди (1)

Чувствителност на теста

	всички	всички
	отрицателни	положителни
Бензилпеницилин	0,002	0,006
Ампицилин	0,002	0,005
Клоксацин	0,015	0,035
Нафцилин	0,006	0,011
Тетрациклин	0,10	0,40
Окситетрациклин	0,20	0,45
Хлортетрациклин	0,15	0,50
Хлорамфеникол	7,	15,
Дихидрострептомицин	4,	13,
Неомицин	1,	22,
Канамицин	9,	28,
Бацитрацин	0,06	0,14
Еритромицин	1,	2,25
Рифамицин	0,01	0,14
Диафенилсулфон	0,01	0,1
Сулфаметазин
(Сулфадимидин)	0,5	1,

(1) Бензилпеницилинът и бацитрацинът се изразяват в IU/ml, докато всички останали антибиотици се представят в mg/ml.

2. Определение

Млякото съдържа антибиотици или сулфонамиди, когато изследваната по описания метод хранителна среда не промени цвета си (вж. т. 7.1).

3. Принцип

Пробата мляко заедно с хранителните съставки се добавя към агарна хранителна среда, съдържаща pH-индикатор и спори на Bacillus stearothermophilus var.calidolactis, щам ATCC 10149 (вж. т. 5.4.1), който проявява много добра обща чувствителност и в частност чувствителност към инхибирането от пеницилин. Култивирането на средата, което води до нормален растеж на организмите и киселинообразуване, променя цвета на pH-индикатора от пурпурен в жълт. Наличието в млякото на потискащи растежа на организмите вещества не причинява промяна в пурпурния цвят на индикатора.

4. Апаратура и лабораторна стъклария

Стандартно лабораторно оборудване:

4.1. Апаратура

4.1.1. Инкубатор (термостат), работещ при температура от 64 +/- 1 градуса C.

4.1.2. Водна баня, поддържаща температура от 64 +/- 1 градуса C.

4.1.3. Статив-решетка за епруветки или ампули.

4.1.4. Пипети с краища за еднократна употреба, подходящи за вземане на проби и дозиране на 0,1 ml.

4.1.5. Пинсети или щипци.

4.1.6. Сух стерилизатор, работещ при температура 170 до 175 градуса C.

4.1.7. Автоклав, поддържащ температура от 121 +/- 1 градуса C.

4.1.8. pH-метър.

4.2. Лабораторна стъклария

4.2.1. Стъкла за пробите с подходящи запушалки

Забележка. Използването на някои каучукови запушалки може да доведе до отлагането на инхибиторни вещества по гърлото на стъклото.

4.2.2. Петри от прозрачно безцветно стъкло или стерилен синтетичен материал с гладки дъна и равномерна дебелина на стъклото с вътрешен диаметър най-малко 140 mm.

4.2.3. Шишета с вместимост 250 ml.

4.2.4. Пипети (запушени с памук) от стъкло или стерилен синтетичен материал с вместимост 1 и 10 ml.

4.2.5. Стъклени шпатули

4.2.6. Епруветки или ампули с вътрешен диаметър около 8 mm, с капачки или запушалки.

4.2.7. Стерилизация на лабораторната стъклария

Лабораторната стъклария се стерилизира по един от следните начини:

а) в сух стерилизатор (т. 4.1.6) при температура 170 до 175 градуса C най-малко за един час;

б) в автоклав (т. 4.1.7) при температура 121 +/- 1 градуса C най-малко за 20 мин.

При стерилизация в автоклав трябва да се осигури добър достъп на парата до стъкларията - например ако оборудването се стерилизира в контейнери, то не трябва да бъде плътно затворено, а колбите и стъклата трябва да бъдат с отворени капаци.

Стерилизираната в автоклав лабораторна стъклария се изсушава чрез вентилиране на парата.

Пипетите се стерилизират в сух стерилизатор.

5. Среди, разтвори, тест-организъм

Съставките на хранителната среда трябва да отговарят на бактериологичните изисквания. Използваната вода трябва да бъде дестилирана в стъкло или деминерализирана с равностойна чистота, която не съдържа потискащи растежа на тест-организма вещества.

5.1. Среди

5.1.1. Хранителен агар - полегат агар за поддържане на тест-микроорганизма

Състав: дрождев екстракт - 2 g; пептон - 5 g; екстракт от месо - 1 g; натриев хлорид - 5 g; агар - 10 - 15 g; вода - 1000 ml.

Приготвяне на средата

Съставките се разтварят във вода. Разтворът се нагрява до кипене, като периодично се разклаща. Коригира се pH, така че след стерилизацията да е 7,4 +/- 0,1 при температура 25 градуса C. Средата се разлива в количества от 10 ml в епруветки, за да се приготви впоследствие полегатият агар, или в стъкла по 100 ml. Стерилизира се в автоклав при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 мин.

5.1.2. Агарова среда за доказване на антибиотици

Състав: натриев хлорид - 2 g; агар - 15 g; вода - 1000 ml; разтвор на триметоприм или тетроксоприм (вж. т. 5.1.3) - 10 ml.

Приготвяне на средата

Всички съставки с изключение на триметоприма или тетроксоприма се разтварят във вода. Разтворът се нагрява до кипене, като периодично се разклаща. Добавя се триметопримът или тетроксопримът, след което се автоклавира при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 мин. Коригира се pH, така че след стерилизацията да е 7,0 +/- 0,1 при температура 25 градуса C.

5.1.3. Разтвор на триметоприм или тетроксоприм

Състав: триметоприм - 5 mg, или тетроксоприм - 30 mg; етанол 96 % - 5 ml/30 ml; вода в количество до обем - 1000 ml.

Приготвяне на разтвора

Триметопримът или тетроксопримът се разтваря в етанол (5 или 30 ml) и се разрежда с вода.

5.1.4. Хранителна среда с индикатор

Състав: дрождев екстракт - 0,75 mg; глюкоза - 5,0 mg; разтворимо нишесте - 8,0 mg; бромкрезол пурпур - 0,025 g; вода до обем - 50 ml.

Приготвяне на средата

Хранителните вещества и индикаторът се разтварят във вода при необходимост чрез нагряване. Разтворът се стерилизира чрез зайц-филтър. Хранителните вещества се предлагат в готов вид на пазара под формата на таблети.

5.2. Стандартни пеницилинови разтвори

5.2.1. Приготвя се разтвор на пеницилин от 60 mg/ml = (100 IU/ml) чрез разтварянето на натриев или калиев-бензил-пеницилин на кристали и стерилна дестилирана вода в стерилно стъкло, снабдено с подходяща запушалка.

5.2.2. Приготвя се работен разтвор на пеницилин, като 1,25 ml от стандартния пеницилинов разтвор (т. 5.2.1) се разрежда със стерилна дестилирана вода в обем 1000 ml. Работният разтвор съдържа 0,075 mg (= 0,125 IU/ml).

5.2.3. Приготвя се стандартен пеницилинов разтвор от 75 ml, съдържащ 0,004 mg/ml (= 0,0067 IU/ml), чрез добавянето и смесването на 71 ml свободно от инхибиторни вещества мляко (т. 5.3) и 4 ml от работния пеницилинов разтвор (т. 5.2.2).

5.2.4. Пеницилиновите разтвори, посочени в т. 5.2.1 - 5.2.3, се приготвят в деня на изследването.

5.3. Свободно от инхибиторни вещества мляко

Приготвя се контролен разтвор на свободно от потискащи вещества мляко чрез възстановяването на обезмаслено мляко на прах (10 % m/v), предварително изследвано за отсъствието на инхибитори в стерилна дестилирана вода. Възможно е също така да се използва достатъчно количество мляко от сборна проба, за което е доказано, че е свободно от инхибиторни вещества. Млякото се разлива в стъкла и се нагрява в продължение на един час при температура 100 градуса C. Съхранява се в хладилник при температура 0 до 6 градуса C в продължение до една седмица.

5.4. Тест-организъм

5.4.1. Като тест-организъм се използва Bacillus stearothermophilus var. calidolactus, щам ATCC 10149, който е идентичен с щам C953.

5.4.2. За поддържане на тест-културата се приготвя бульонна култура. Тест-културата се поддържа върху полегат хранителен агар, посят с ухо (йозе) с бактериалната среда и инкубиран аеробно в продължение на 48 часа при температура 63 +/- 1 градуса C. След приключване на култивирането епруветката с полегатия агар се затваря херметически със стерилна каучукова запушалка. Така получената бульонна култура може да се съхранява до няколко месеца в хладилник при температура от 0 до 5 градуса C.

5.5. Тест-култура (спорова суспензия)

5.5.1. Двадесет ml от хранителния агар (т. 5.1.1) се прехвърля асептично в стерилно петри (т. 4.2.2), което се охлажда до стайна температура.

5.5.2. Пет ml стерилна дестилирана вода се прехвърля със стерилна пипета (т. 4.2.4) в епруветката с бульонната култура (т. 5.4.2) за отмиване на спорите от наклонения агар чрез стерилно ухо (йозе). Така получената спорова суспенсия се съхранява при температура 0 до 5 градуса C и е годна за употреба до 36 часа след приготвянето й.

5.5.3. Половин ml от споровата суспензия (т. 5.5.2) се прехвърля със стерилна пипета (т. 4.2.4) върху тест-културата (т. 5.5.1), като посявката се разстила равномерно по цялата повърхност с помощта на стъклено бастунче, след което се култивира при температура 63 +/- 1 градуса C (т. 4.1.1) в продължение на 16 до 18 часа.

При използването на бульонна култура (т. 5.4.2) или култура, която е престояла повече от 36 часа, културата се опреснява най-малко два пъти, като интервалът между двете препосявания не трябва да превишава 36 часа.

5.5.4. Десет ml дестилирана вода се прехвърля със стерилна пипета (т. 4.2.4) върху културата (т. 5.5.3), като спорите от повърхността се отстраняват в суспензията с помощта на стъклена пръчка.

Споровата суспензия се прехвърля в стъкло (т. 4.2.3) с 250 ml стерилна дестилирана вода. Стъклото се затваря и разклаща. Култури, които не подлежат на незабавно опресняване, се съхраняват в хладилник при температура от 0 до 6 градуса C.

5.5.5. След култивиране на споровата суспензия върху агарна среда при температура 63 +/- 1 градуса C в продължение на 16 до 18 часа броят на жизнеспособните микроорганизми в нея трябва да е между 5 и 10 000 000/ml. Мътността на суспензията трябва да бъде еднородна. Култури, в които се наблюдават флокули (плуваща влакнеста утайка) или седимент, се изхвърлят. От бульонната култура (полегатия агар) (т. 5.4.2) се приготвя нова суспензия.

5.6. Подготовка на епруветките/ампулите

5.6.1. Агарната среда (т. 5.1.2) се разтапя и охлажда до 55 градуса C.

5.6.2. Една част от прясно приготвената спорова суспензия (т. 5.5.4) се прибавя към пет части от агарната среда в епруветка или стъкло (т. 5.6.1). Разбъркват се добре.

5.6.3. 0,3 ml от прясно приготвената, непосята среда (т. 5.6.2) се прехвърлят в стерилна епруветка или ампула (т. 4.2.6) до образуването на слой с дебелина 5 mm, след което последната се затваря със запушалка или капачка. Епруветките/ампулите се охлаждат изправени до втвърдяване на средата. Вече втвърдена, средата се оставя да престои за не по-малко от 12 часа.

5.6.4. Епруветките/ампулите могат да се използват същия ден или да бъдат съхранени за няколко месеца, ако се охладят непосредствено след приготвянето им при температура от 0 до 6 градуса C.

6. Процедура

6.1. Пробите се изследват в най-кратък срок - за предпочитане в рамките на 24 часа от вземането им, като междувременно се съхраняват при температура от 0 до 5 градуса C. В противен случай се замразяват дълбоко при -30 - -15 градуса C, за да се сведе до най-малко инактивацията на пеницилин.

6.2. Всяка епруветка/ампула (т. 5.6) се маркира четливо и по незаличим начин. След отстраняване на капачките или запушалките в статива-решетка (т. 4.1.3) се поставят необходимите за пробите и контролите (т. 5.2 и 5.3) епруветки/ампули.

6.3. Към всяка от епруветките/ампулите се добавя по 50 ml от хранителната среда (т. 5.1.4).

6.4. Пробата с мляко се размесва добре. 0,1 ml от нея се прехвърля в съответната маркирана епруветка/ампула с помощта на пипета (т. 4.1.4). За всяко прехвърляне се използва накрайник за еднократна употреба.

6.5. Манипулациите, описани в т. 6.4, се повтарят, като вместо пробата с мляко (т. 5.2.3) се използва стандартен пеницилинов разтвор, съдържащ 0,004 mg/ml (=0,0067 IU/ml) пеницилин.

6.6. Манипулациите, описани в т. 6.4, се повтарят, като вместо пробата с мляко се използва контролният разтвор на свободно от инхибиторни вещества мляко (т. 5.3).

6.7. Епруветките/ампулите се затварят и поставят в статива-решетка, който се потапя във водна баня при температура 63 +/- 1 градуса C (т. 4.1.2) за период от 2 ч. и 30 мин. до 2 ч. и 45 мин.

6.8. Стативът-решетка с епруветките/ампулите се изважда от водната баня.

6.9. Изследва се оцветяването на тест-средата (т. 7).

7. Интерпретация на резултатите

7.1. Пурпурното оцветяване на тест-средата в пробата с мляко или епруветките/ампулите с контролата показва наличието на антибиотици или сулфонамиди на или около ниво "Всички положителни", представено в таблицата. Тест-средата е достатъчно чувствителна, ако пурпурното оцветяване на стандартния пеницилинов разтвор (т. 6.5) в епруветките/ампулите остане стабилно.

7.2. Пурпурното оцветяване само на част от тест-средата или неравномерното оцветяване в която и да било епруветка/ампула с пробата мляко показва наличието на инхибиторни вещества в пробата между нивата, представени в таблицата.

7.3. Оцветяването на тест-средата в пробата мляко или контролата в жълто показва отсъствието на потискащи тест-организма вещества.

7.4. Ако във всички изследвани епруветки/ампули, в т. ч. и отрицателната контрола, се наблюдава пурпурно оцветяване, тест-средата не съдържа жизнеспособни микроорганизми и пробите трябва да се подложат на повторно изследване, като за целта се приготви нов тест-материал.

8. Потвърждаване на резултатите

8.1. Пробите се потвърждават с описаните в т. 7.1 и 7.2 реакции в съответствие с метод II.

Ако пробите с мляко не бъдат подложени веднага на тест за потвърждаване на резултатите, те се съхраняват дълбоко замразени, за да се избегне разграждането на антибиотиците.

II. Метод за потвърждаване наличието на пеницилин и определяне на концентрацията му

1. Приложение

Методът определя начините за потвърждаване наличието на пеницилин или различни от пеницилина антибиотици и за определяне концентрацията на пеницилин в проби, показали положителни или междинни реакции (метод I, т. 7.1 и 7.2).

Чувствителността на различните антибиотици се определя по начините, описани в метод I, т. 1.

2. Определение

2.1. Ако около диска се появи светла зона с размери най-малко 2 mm, пробата мляко съдържа антибиотици и сулфонамиди.

2.2. Ако около диска с добавената към пробата мляко, която съдържа антибиотици, включващи сулфонамид (т. 2.1), пеницилиназа (беталакматаза), не се появи светла зона или се наблюдава светла зона с по-малък диаметър от този на пробата без пеницилиназа, инхибиторното вещество е пеницилин или пеницилин и друг антибиотик, включващ сулфонамиди.

2.3. Ако зоната около диска не бъде инактивирана от пеницилиназата (т. 2.2), пробата мляко съдържа различен от пеницилина инхибитор.

Някои полусинтетични пеницилини като натриевият клоксацилин не се инактивират, само частично се инактивират или са напълно устойчиви на пеницилиназата и следователно се определят като инхибитори, различни от пеницилина (т. 7.3).

3. Принцип

Книжен филтърен диск, натопен в изследваното мляко, се поставя върху агарна среда, предварително засята с Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis. Култивирането, което води до растеж на тест-организма, причинява помътняване на агара. Наличието на потискащи растежа на организма вещества в млякото се доказва с появата на светла зона около диска. Размерът на зоната зависи наред с други неща и от концентрацията и вида на инхибитора в млякото.

4. Апаратура, лабораторна стъклария и оборудване

4.1. Апаратура

4.1.1. Вж. метод I, т. 4.1.

4.1.2. Водна баня, работеща при температура 80 +/- 1 градуса C.

4.2. Лабораторна стъклария - вж. метод I, т. 4.2.

4.3. Книжни дискове, свободни от инхибитори, с диаметър 9 - 13 mm, с вместимост около 130 mg. Препоръчва се да се съхраняват в ексикатор.

5. Среди, стандартни разтвори, разтвор на пеницилиназата, реактиви, тест-организъм и др.

Съставките на средата трябва да са подходящи за бактериологични изследвания. Използваната вода трябва да бъде стерилизирана в стъкло или деминерализирана с равностойна чистота и да не съдържа вещества, потискащи растежа на тест-организма.

5.1. Среди

5.1.1. Хранителен агар (метод I, т. 5.1.1)

5.1.2. Тест-среда за доказване наличието на инхибиторни вещества

Състав: дрождев екстракт - 2,5 g; триптон - 5 g; глюкоза - 1 g; разтвор на триметоприм или тетроксоприм (метод I, т. 5.1.3) - 10 ml; агар - 10 - 15 g (в зависимост от желиращите свойства на използвания агар); вода - 1000 ml.

Приготвяне на средата

Твърдите съставки се разтварят напълно чрез нагряване и разбъркване. Добавя се разтворът на триметоприм или тетроксоприм. Коригира се pH, така че след стерилизацията да бъде равна на 8,0 + 0,1 при температура 25 градуса C. Средата се стерилизира в автоклав при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 минути.

5.2. Стандартни пеницилинови разтвори - виж метод I, т. 5.2.

За количественото определяне на инхибиторните вещества (т. 8) се приготвят стандартни пеницилинови разтвори в свободно от потискащи субстанции мляко (метод I, т. 5.3) в следните концентрации:

a) 0,004 mg/ml (0,0067 IU/ml);

б) 0,006 mg/ml (0,01 IU/ml);

в) 0,03 mg/ml (0,05 IU/ml);

г) 0,06 mg/ml (0,1 IU/ml).

5.3. Разтвор на пеницилиназа

5.3.1. Разтваря се пеницилиназа (беталакматаза) в стерилна дестилирана вода за получаването на концентрация 1000 U/ml. Разделен на малки части, разтворът може да се съхранява до две седмици при температура от 0 до 5 градуса C.

Забележка. Няма установен международен стандарт за активността на пеницилиназата. Затова за целите на метода се приема, че 10 единици пеницилиназа са достатъчни да инактивират 0,6 mg (= 1 IU) пеницилин. Активността на отделните препарати трябва да бъде проверявана и ако не отговаря на гореописаните изисквания, съответно да се коригира концентрацията на пеницилиназата.

5.3.2. Вместо разтвор на пеницилиназа могат да се използват предлаганите на пазара готови дискове, като след проверка се установи, че съдържат необходимото количество пеницилиназа.

5.4. Тест-организъм - вж. метод I, т. 5.4.

5.5. Тест-култура (спорова суспензия) - виж метод A, т. 5.5.

5.6. Приготвяне на посевките за изследване

5.6.1. Тест-средата се разтапя за доказване на инхибиторни вещества (т. 5.1.2) и след това се охлажда до температура 55 градуса C.

5.6.2. В стъкло се прибавя една част от прясно приготвената спорова суспензия (т. 5.5) към толкова части от тест-средата (т. 5.1.2), колкото са необходими за получаване на необходимата плътност на колониите в незасятата тест-среда, след което съдържанието се размесва добре.

5.6.3. В предварително затоплено до 55 градуса C стерилно петриево блюдо (метод I, т. 4.2.2) се прехвърля достатъчно количество от непосятата тест-среда (т. 5.6.2) за образуването на слой с дебелина 0,6 до 0,8 mm. За получаването на слой с дебелина 0,8 mm в петри с вътрешен диаметър 140 mm са необходими около 15 ml от тест-средата.

5.6.4. Петритата се поставят отворени върху студена, предварително нивелирана хоризонтална повърхност до втвърдяване на агарната среда. След втвърдяването на средата петритата се затварят с капаци и се обръщат, така че кондензацията на вода по повърхността на средата да се намали до минимум.

5.6.5. За предпочитане е така приготвените посевки за изследване да бъдат използвани още същия ден. В противен случай те могат да се съхраняват в непосредствено запечатани след приготвянето им полиетиленови пликове при температура 5 градуса C до две седмици.

5.6.6. За да се улесни идентифицирането на посевките, дъното на петриевите панички се обозначава със съответната маркировка или номер.

6. Процедура

6.1. Подготовка на пробата

6.1.1. Проби с положителни или междинни реакции съгласно метод I (т. 7.1 и 7.2) подлежат на повторно изследване с цел идентифицирането и количественото определяне на пеницилина.

6.1.2. Първоначално въпросните проби се нагряват до температура 80 +/- 1 градуса C за 10 минути с цел да се избегне влиянието на термолабилни неспецифични инхибитори.

6.1.3. След като бъде добре размесено, 10 ml от предварително затопленото мляко за изследване се прехвърля в подходящо стъкло с широко гърло. Добавя се около 0,4 ml разтвор на пеницилиназа (т. 5.3) и се разбърква добре.

6.2. Доказване наличието на инхибиторни вещества

6.2.1. С помощта на сухи пинсети в пробата мляко (т. 6.1.2) се потапя книжен диск (т. 4.3). Излишното мляко се отстранява чрез притискане на диска към стената на стъклото с пробата. Дискът се поставя върху повърхността на посявката (т. 5.6) и се притиска леко с пинсетите.

6.2.2. Дисковете, потопени в различните проби с мляко, трябва да се поставят на разстояние най-малко 20 mm един от друг и най-малко 10 mm от края на посявката.

6.2.3. За проверка на чувствителността дисковете (т. 4.3), напоени със стандартен пеницилинов разтвор (т. 5.2), се поставят без определен ред между дисковете, напоени с млякото за изследване, в съотношение 2:1. За всяко изследване се използват най-малко 5 диска със стандартен разтвор.

6.2.4. След като дисковете се поставят върху агаровата среда без определен ред и се идентифицират, петритата с посевките се обръщат обратно и термостатират при температура 63 +/- 1 градуса C в продължение на 2 ч. и 30 мин. до 5 часа.

6.2.5. След култивиране посевките се изследват на подходяща светлина за образуване на зони на инхибиране около книжните дискове. Измерват се образувалите се около диска светли зони.

6.2.6. Зоните, образували се около диска, напоен със стандартен пеницилинов разтвор (т. 6.2.3), трябва да са с диаметър не по-малко от 2 mm.

6.2.7. Светлите зони около дискове, напоени с млякото за изследване, с диаметър, равен или по-голям от този, посочен в т. 6.2.6, показва наличието на потискащи растежа на тест-организма вещества.

6.3. Идентифициране и количествено определяне на инхибиторните вещества

6.3.1. Процедурата, описана в т. 6.2.1, се провежда чрез паралелни проби от предварително затопленото мляко за изследване (т. 6.1.2) и третираната с пеницилиназа проба (т. 6.1.3). Вместо разтвора, получен от прибавянето на пеницилиназа към 10 ml от пробата с мляко, може да бъде използван предварително приготвен с разтвор на пеницилиназа диск (т. 5.3.2), напоен с млякото за изследване и поставен върху посявката.

6.3.2. Процедурата, описана в т. 6.2.1, се провежда с паралелни проби за всеки стандартен пеницилинов разтвор, приготвен съгласно т. 5.2 (а - г).

6.3.3. Определят се средните диаметри на светлите зони на инхибиране както за пробата с мляко и контролата, съдържаща пеницилиназа, така и за стандартните пеницилинови разтвори.

7. Интерпретация на резултатите (вж. т. 2)

7.1. Ако около диска с контролния разтвор на пеницилиназа не се появи светла зона, но такава се образува около диска с пробата мляко, чийто диаметър е равен или по-голям от този на диска със стандартния пеницилинов разтвор (т. 5.2, а), съдържащият се в пробата инхибитор съответства на концентрацията на натриев (калиев)-бензил-пеницилин от най-малко 0,004 mg/ml.

7.2. Ако средният диаметър на светлата зона около диска, напоен с разтвора на пеницилиназа, е равен на средния диаметър на светлата зона около диска, напоен с млякото, млякото съдържа потискащи вещества, които използваните в този метод концентрации на разтвора с пеницилиназа не могат да инактивират.

7.3. Ако средният размер на светлата зона около диска, напоен с разтвора на пеницилиназа, е по-малък от средния диаметър на светлата зона около диска, напоен с предварително нагрятата съгласно т. 6.1.2 проба мляко, освен пеницилин или полусинтетичен пеницилин, който не може да бъде идентифициран с използваната в този метод концентрация на пеницилиназата, млякото съдържа пеницилин и други антибиотици, включващи сулфонамиди. Синтетичните пеницилини като натриевия клоксацин например могат да не бъдат инактивирани от пеницилиназата при условията на опита и следователно могат да бъдат класифицирани като инхибитори, различни от пеницилина.

Забележка. При необходимост за доказване наличието на различни от пеницилина инхибитори се използват подходящи за целта методи.

8. Определяне съдържанието на пеницилин

8.1. Съдържанието на пеницилин може да се определи чрез построяване на стандартна крива или да се изчисли въз основа на размерите на зоните, получени от стандартните пеницилинови разтвори в млякото (т. 5.2, а - г).

8.2. Построяване на стандартна крива

Тъй като между log10 на концентрацията на пеницилина и диаметъра на зоните на инхибиране съществува линейна зависимост, стандартната крива може да се построи на милиметрова хартия, като концентрацията на пеницилина се представи по ординатата, а зоните на инхибиране - по абсцисата. Зоните на инхибиране се изчисляват като средна стойност от паралелно проведените опити. Диаметрите на зоните се нанасят срещу различните стойности на концентрация на стандартните пеницилинови разтвори. Отделните точки се свързват, за да се получи стандартната крива.

8.3. Изчисляване на резултатите

Различната концентрация на пеницилин в млякото се изчислява въз основа на диаметрите на зоните чрез подходящо уравнение или стандартната крива. За по-голяма точност на анализа радиусът на зоните на инхибиране трябва да е най-малко два пъти и най-много пет пъти по-голям от радиусите на дисковете.

9. Представяне на резултатите

9.1. Резултатите се представят като количество пеницилин, равно или надвишаващо 0,004 mg/ml (или чрез посочване на определената концентрация), или количество инхибитори, различни от пеницилина.

9.2. Повторяемост (r) и възпроизводимост (R)

Няма значими числени стойности, тъй като се използва стандарт за сравнение.

Приложение № 9 към чл. 28, ал. 1, т. 2

Определяне на фосфатазната активност

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за определяне на фосфатазната активност в пастьоризираното мляко.

2. Определение

Фосфатазната активност се определя от количеството на намиращата се в продукта активна алкална фосфатаза, изразена като количество фенол в микрограмове, отделен при описаните условия след влизане в реакция с 1 ml пастьоризирано мляко.

Мляко с фосфатазна активност под 4 mg/ml се определя като фосфатазно отрицателно.

3. Принцип

Фосфатазната активност се определя от количеството фенол, освободен от динатриевия фенилфосфат, добавен към пробата. Освободеният фенол влиза в реакция с дибромохинон хлоримид и дава дибромоиндофенол (синкав на цвят), който се измерва колометрично при дължина на вълната 610 nm. Прави се сравнение с пробата, съдържаща разрушения фосфатазен ензим.

4. Реактиви

4.1. Буфер - бариева основа - борна киселина

4.1.1. 50,0 g бариева основа [Ba(ОH)2.8H2О] се разтваря във вода и разтворът се довежда до обем 1000 ml.

4.1.2. 22,0 g борна киселина [H3BО3] се разтваря във вода и разтворът се довежда до обем 1000 ml.

4.1.3. 500 ml от всеки разтвор се загрява до 50 градуса C, след което разтворите се смесват добре, разбъркват се и бързо се охлаждат до 20 градуса C. При необходимост pH се коригира до 10,6 +/- 0,1 чрез добавянето на още разтвор (т. 4.1.1. или 4.1.2). Филтрира се и се съхранява в плътно затворен контейнер.

4.1.4. Преди употреба разтворът се разрежда с равен обем вода.

4.2. Буфер за проявяване на оцветяването

6,0 g натриев метаборат (NaBО2) или 12,6 g (NaBО2.4H2О) се разтваря с 20,0 g натриев хлорид (NaCl) във вода и разтворът се довежда до обем 1000 ml.

4.3. Буфер за оцветяване на разреждането

10 ml от буфера за проявяване на оцветяването (т. 4.2) се разрежда с вода до 100 ml.

4.4. Буферен субстрат

0,1 g свободен от обезводнен фенол динатриев фенилфосфат се разтваря в 100 ml буфер (т. 4.1.3) или 0,5 g динатриев фенилфосфат се разтваря в 4,5 ml буфер за проявяване на оцветяването (т. 4.2), прибавят се две капки дибромохинон хлоримид (т. 4.6 - BQC - разтвор) и се оставя да престои на стайна температура 30 мин. Полученото оцветяване се екстрахира с 2,5 ml бутан-1-ол и се оставя да престои до отделянето на субстанцията, след което последната се декантира и изхвърля. При необходимост екстракцията се повтаря.

Разтворът може да се съхранява в хладилник за няколко дни. Преди употреба оцветяването се проявява и екстрахира отново. Буферният субстрат се приготвя непосредствено преди употреба, като 1 ml от този разтвор се разрежда с буферния разтвор (т. 4.1.3) до 100 ml.

4.5. Цинково-меден преципитант (утаителен агент)

3,0 g цинков сулфат (ZnSО4, 7H2О) и 0,6 g меден (II) сулфат (CuSО4, 5H2О) се разтварят във вода и разтворът се довежда до обем от 100 ml.

4.6. 2,6-дибромхинон хлоримид (BQC - разтвор)

40 +/- 1 mg 2,6-дибромхинон хлоримид (BQC) (C6H2Br2CINО6)се разтваря в 10 ml етанол 96 % (v/v).

Разтворът се съхранява в тъмно стъкло в хладилник. При промяна в цвета или при престой повече от един месец се изхвърля.

4.7. Разтвор на меден сулфат

0,05 g меден (II) сулфат (CuSО4.5H2О) се разтваря във вода и разтворът се довежда до обем от 100 ml.

4.8. Стандартен фенолов разтвор

4.8.1. Претегля се 200 +/- 2 mg чист безводен фенол и се прехвърля в мерителна колба от 100 ml. Фенолът се разтваря с вода, смесва се и се допълва до марката. Съхраняван в хладилник, основният разтвор е годен за употреба в продължение на няколко месеца.

4.8.2. 10 ml от основния разтвор се разреждат с вода до 100 ml. Разтворът се смесва добре. 1 ml съдържа 200 mg фенол.

5. Апаратура и лабораторна стъклария

Стандартно лабораторно оборудване:

5.1. Аналитични везни.

5.2. Водна баня с контролирана температура при 37 +/- 1 градуса C.

5.3. Спектрофотометър с възможност за отчитане при дължина на вълната от 610 nm.

5.4. Епруветки с размери 16 или 18 mm x 150 mm, градуирани за предпочитане на 5 и 10 ml.

5.5. Пипети.

5.6. Стъклени фунии с подходяща големина и диаметър 5 cm.

5.7. Сгънати филтри с диаметър не по-малък от 9 cm за средна скорост на филтрация.

5.8. Мерителни колби за подготовка на стандартни разтвори.

Забележка: Лабораторната стъклария, запушалките и инструментите за вземане на проби трябва да бъдат внимателно почистени. Препоръчва се да се изплакнат с прясно преварена дестилирана вода или да се обработят с пара.

Забранява се употребата на запушалки, направени от фенолни пластмаси, тъй като могат да причинят замърсяване с фенол.

6. Процедура

6.1. Подготовка на пробата за изследване

6.1.1. Анализът се извършва веднага след вземане на пробата. В противен случай пробата се съхранява в хладилник.

Забележка: По време на определянето да се избягва влиянието на пряката слънчева светлина. Да се избягва замърсяването със следи от слюнка или пот, тъй като води до неточни положителни резултати. Специално внимание се обръща на пипетирането.

6.2. Тест-порция

С помощта на пипета се поставя по 1 ml от пробата за изследване в две епруветки (т. 5.4), една от които служи за провеждане на контролата или празната проба.

6.3. Определяне

6.3.1. Празната проба се нагрява в кипяща вода две минути; епруветката и бехеровата чаша с кипяща вода се покриват с алуминиево фолио, за да се загрее цялата епруветка. Охлажда се бързо до стайна температура.

6.3.2. До края на процедурата празната проба и пробата за изследване се третират по един и същ начин. Прибавя се по 10 ml от буферния субстрат (т. 4.4) и съдържанието се размесва добре.

6.3.3. Пробите се поставят незабавно във водна баня (т. 5.2) за 60 мин., като съдържанието им периодично (не по-малко от 4 пъти) се разбърква.

6.3.4. Епруветките се нагряват на кипяща вода за две минути, както е описано в т. 6.3.1, след което се охлаждат бързо до стайна температура.

6.3.5. Към всяка епруветка се прибавя по 1 ml от цинково-медния преципитант (т. 4.5) и съдържанието се разбърква добре.

6.3.6. Филтрира се през суха филтърна хартия. Първите 2 ml се изхвърлят. При необходимост се филтрира отново до пълното избистряне на филтрата. 5 ml от бистрия филтрат се поставят в епруветка.

6.3.7. Прибавя се 5 ml от буфера за проявяване на оцветяването (т. 4.2).

6.3.8. Добавя се 0,1 ml от BQC-разтвора (т. 4.6) и съдържанието се смесва добре. Оцветяването се проявява на стайна температура в продължение на 30 мин.

6.3.9. Оптическата плътност се измерва чрез сравнение с контролната или празната проба в спектрофотометър (т. 5.3) при дължина на вълната 610 nm.

6.3.10. Определянето се повтаря с подходящо разреждане на пробата, ако измерената съгласно т. 6.3.9 оптическа плътност е по-висока от тази на еталона, съдържащ 20 mg фенол във всяка епруветка, определен в съответствие с т. 6.4.4. Разреждането се приготвя чрез смесването на един обем от пробата за изследване с подходящ обем на част от същата проба, внимателно нагрети до кипене за инактивиране на фосфатазата.

6.4. Построяване на стандартна (калибрационна) крива

6.4.1. Приготвя се подходяща серия от разредени стандартни разтвори, като се започва от стандартния фенолов разтвор, съдържащ 0 (контрола или празна проба), 2, 5, 10 и 20 mg фенол на милилитър. В пет епруветки се отмерват съответно по 1 ml вода и 1 ml от четирите стандартни фенолови разтвора.

6.4.2. Към всяка епруветка се добавят 1 ml разтвор на меден (II) сулфат (т. 4.7), 5 ml от буфера за оцветяване на разреждането (т. 4.3), 3 ml вода и 0,1 ml BQC- разтвор (т. 4.6), след което съдържанието се смесва.

6.4.3. Оцветяването се проявява за 30 мин. на стайна температура.

6.4.4. Оптическата плътност се измерва чрез сравнение с контролната или празната проба в спектрофотометър при дължина на вълната 610 nm (т. 5.3).

6.4.5. Изчислява се получената регресия чрез най-малкия корен квадратен въз основа на получените за всяко добавено количество фенол (т. 6.4.1) стойности на оптическата плътност (т. 6.4.4).

7. Изчисляване на резултатите

7.1. Изчисления и формули

7.1.1. Количеството фенол се изчислява въз основа на стойността на оптическата плътност, отчетена в т. 6.3.9, като се използва получената регресия (т. 6.4.5).

7.1.2. Фосфатазната активност на пастьоризираното мляко, изразена в микрограмове фенол на милилитър, се изчислява по формулата:

Фосфатазна активност = 2,4 x A x D,

където:

A е количеството фенол в микрограмове, получено по т. 7.1.1;

D - факторът на разреждане на разтворите по т. 6.3.10; при неразредени проби D = 1;

2,4 - факторът на разреждане (5/12 от 1 ml проба за изследване). Виж т. 6.2 във връзка с т. 6.3.2, 6.3.5 и 6.3.6.

7.2. Точност на определянето

7.2.1. Повторяемост (r): 2 mg фенол/ml.

7.2.2. Възпроизводимост (R): 3 (предварително) mg фенол/ml.

7.2.3. При разреждане на пробите (т. 6.3.10) пределната стойност, определена в т. 7.2.1 и 7.2.2, се отнася за резултатите, получени при използването на разредена проба.

Приложение № 10 към чл. 28, ал. 1, т. 2

Определяне на пероксидазната активност

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за определяне активността на ензима пероксидаза като критерий за ефективността на пастьоризацията.

2. Определение

Положителна реакция - когато млякото е правилно пастьоризирано, след разбъркване в рамките на 30 сек. се появява синьо оцветяване.

Отрицателна реакция - след разбъркване цветът на изследваната проба не се променя.

3. Принцип

Ензимът пероксидаза разлага въглеродния прекис. Освободеният кислород окислява безцветния 1,4-фенилендиамин в пурпурен индофенол (тест на Сторч). Интензивността на цвета е пропорционална на концентрацията на ензима.

4. Реактиви

4.1. Разтвор на 1,4-фенилендиамин

2 g 1,4-фенилендиамин (C6H8N2) се разтваря в топла вода (50 градуса C). Разтворът се довежда до обем 100 ml. Съхранява се в кафяво шише със стъклена запушалка на тъмно и хладно място. След като бъде приготвен, разтворът на 1,4-фенилендиамин образува седимент в рамките на ден или два. При появата на утайка разтворът се изхвърля.

4.2. Разтвор на въглероден прекис

9 ml въглероден прекис (30 %) се разрежда с вода и довежда до обем 100 ml. Разтворът се стабилизира с концентрирана сярна киселина - 1 ml/l разтвор.

Разтворът на въглероден прекис е годен за употреба в продължение на 1 месец, ако се съхранява на тъмно и хладно място в бутилка със стъклена запушалка, предотвратяваща какъвто и да било контакт с органични вещества.

5. Процедура

5.1. 5 ml от изследваното мляко се поставят в чиста епруветка с подходяща запушалка.

5.2. Прибавя се 5 ml 1,4-фенилендиамин (т. 4.1).

5.3. Добавят се две капки въглероден прекис (т. 4.2).

5.4. След разбъркване се следи за появата на оцветяване. Реакцията се определя като неспецифична, ако синьото оцветяване се появи 30 сек. след добавянето на реактивите.

Приложение № 11 към чл. 28, ал. 2

Изброяване на общ брой психротрофни микроорганизми (бърза техника на броене на колониите) за 25 часа при 21 градуса С

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за изброяване на микроорганизмите чрез метода за изброяване на колониите при температура 21 градуса C за пастьоризираното мляко след 5-дневна култивация при температура 6 градуса C с цел определяне степента на замърсяване с психотрофни микроорганизми, способни да се размножават при температура 6 градуса C.

2. Определение

Под "микроорганизми" се разбира микроорганизми, способни да образуват изброими колонии при аеробно култивиране при описаните условия.

3. Принцип

Пастьоризираното мляко се инкубира при температура 6 градуса C в продължение на пет дни. Определен обем от пробата с мляко за изследване се смесва с хранителна среда в петриеви панички и се инкубира при температура 21 градуса C в продължение на 25 часа. Определя се броят на колонообразуващите единици и се изчислява общият брой на микроорганизмите в 1 ml пастьоризирано мляко.

4. Апаратура и лабораторна стъклария

Стандартно лабораторно оборудване:

4.1. Апаратура

4.1.1. Стерилизатор на горещ въздух при температура от 170 до 175 градуса C.

4.1.2. Автоклав, работещ при температура 121 +/- 1 градуса C.

4.1.3. Инкубатор (термостат), който поддържа температура:

а) 6 +/- 0,2 градуса C ;

б) 21 +/- 1 градуса C в цялото работно пространство.

4.1.4. pH-метър с компенсация на температурата и точност +/- 0,1 pH.

4.1.5. Водна баня с регулатор на температурата при 45 +/- 1 градуса C.

4.1.6. Лупа с увеличение 2 - 4x.

4.1.7. Лупа с увеличение 8 - 10x.

4.1.8. Броителна камера/регистриращ брояч.

4.1.9. Миксер за разбъркване на 1 ml от пробата или десетократно разреждане с 9 ml разредител, работещ на принципа на ексцентричната ротация.

4.2. Лабораторна стъклария

4.2.1. Епруветки с подходящи запушалки и пространство за разбъркване на съдържанието и вместимост за 10 ml основно разреждане или други десетократни разреждания.

4.2.2. Колби с вместимост от 150 до 250 ml или епруветки с приблизителна вместимост от 20 ml за хранителната среда.

4.2.3. Пипети (с памучни запушалки) от стъкло или стерилен синтетичен материал със здрав край, с номинална вместимост от 1 ml и отвор с диаметър 1,75 до 3 mm.

4.2.4. Петри от безцветно прозрачно стъкло или стерилен синтетичен материал, с вътрешен диаметър на долната паничка от около 90 - 100 mm и дълбочина най-малко 10 mm. Дъното трябва да бъде гладко, за да не пречи на точното преброяване на колониите.

4.2.5. Стерилизация на лабораторната стъклария

Лабораторната стъклария се стерилизира по един от следните начини:

а) в сушилня на горещ въздух при температура от 170 до 175 градуса C за не по-малко от един час (т. 4.1.1);

б) в автоклав (т. 4.2.1) при температура 121 +/- 1 градуса C за не по-малко от 20 мин.

При стерилизация в автоклав трябва да се осигури добър достъп на парата до стъкларията. Така например, ако оборудването се стерилизира в контейнери, те не трябва да бъдат плътно затворени, а колбите трябва да са с отворени капаци.

Стерилизираната в автоклав лабораторна стъклария се изсушава чрез вентилиране на парата.

Пипетите се стерилизират в сушилня на горещ въздух (т. 4.1.1).

5. Хранителна среда - агар за изброяване на микроорганизмите

5.1. Състав на средата: дрождев екстракт - 2,5 g; триптон - 5,0 g; глюкоза D (+) или декстроза - 1,0 g; обезмаслено мляко на прах - 1,0 g; агар - 10 до 15 g в зависимост от желиращите свойства на използвания агар; вода - 1000 ml.

Обезмасленото мляко на прах трябва да бъде свободно от инхибиторни вещества, което се определя чрез сравнителни изследвания, ползващи обезмаслено мляко на прах, за което се знае, че е свободно от инхибитори.

Приготвяне на хранителната среда

Съставките се суспендират и разтварят във водата в следната последователност: дрождев екстракт, триптон, глюкоза, обезмасленото мляко на прах. Нагряването на суспенсията улеснява манипулацията. Прибавя се агарът и се нагрява до кипене, като непрекъснато се разбърква до пълното му разтваряне или се разтваря на пара в продължение на 30 мин.

При необходимост се филтрира през филтърна

хартия.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява активната киселинност на средата и при необходимост се коригира, така че след стерилизацията тя да е равна на 6,9 +/- 0,1 при температура 25 градуса C, като се използва разтвор (не по-малко от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

5.2. Разпределяне, стерилизация и съхранение на хранителната среда

Средата (т. 5.1) се разлива в количества по 100 - 150 ml в колби или 12 - 15 ml в епруветки (т. 4.2.2), след което съдовете се затварят със запушалки и се стерилизират в автоклав (т. 4.1.2) при температура 121 +/- 1 градуса C за 15 минути. Проверява се pH на средата. Ако не бъде използвана веднага, хранителната среда се съхранява на тъмно при температура между 1 и 5 градуса C до един месец след приготвянето й.

5.3. Готова суха хранителна среда

Хранителната среда (т. 5.1) може да бъде приготвена и от готова суха среда, като се спазват указанията на производителя. Ако средата не съдържа в състава си обезмаслено мляко на прах, то се прибавя непосредствено преди разтварянето.

Коригира се pH на 6,9 p 0,1 при температура 25 градуса C, както е описано в т. 5.1, след което средата се поставя в съответните съдове, стерилизира се и се съхранява по указаните в т. 5.2 начини.

6. Разредители

6.1. Пептон-солов разтвор

Състав - пептон - 1,0 g; натриев хлорид (NaCl) - 8,5 g; вода - 1000 ml.

Приготвяне

Съставките се разтварят във вода. При необходимост полученият разтвор се нагрява.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява активната киселинност на разредителя и при необходимост се коригира така, че след стерилизацията да е равна на 7,0 +/- 0,1 при температура 25 градуса C, като се използва разтвор (не по-малко от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

6.2. Разпределяне, стерилизация и съхранение на разредителя

Разредителят (т. 6.1) се пресипва в епруветки (т. 4.2.1) в такива количества, че след стерилизация обемът му да е равен на 9,0 +/- 0,2 ml, след което епруветките се затварят със запушалки и се стерилизират в автоклав (т. 4.1.2) при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 мин.

Проверява се pH на разредителя.

Ако не се използват веднага, разредителят се съхранява на тъмно при температура между 1 и 5 градуса C до един месец след приготвянето му.

6.3. Готов сух разредител

Разредителят (т. 6.1) може да бъде приготвен и от готови таблети или прах при спазване указанията на производителя. Коригира се pH на разредителя, както е описано в т. 6.1, и се разпределя в съдове, стерилизира се и се съхранява по указаните в т. 6.2 начини.

7. Процедура

7.1. Разтапяне на хранителната среда

Необходимото количество среда се разтапя бързо и се темперира на водна баня (т. 4.1.5) до 45 +/- 1 градуса C преди началото на микробиологичното изследване.

7.2. Подготовка на пробата мляко

7.2.1. Инкубира се неотворена опаковка пастьоризирано мляко или ако това е невъзможно, представителна проба, съдържаща не по-малко от 100 ml мляко, в продължение на 120 +/- 2 часа при температура 6 +/- 0,5 градуса C в термостат (т. 4.1.3, а).

7.2.2. След инкубацията пробата мляко се размесва добре, така че да се осигури възможно най-равномерно разпределение на микроорганизмите чрез бързо 25-кратно обръщане на контейнера с пробата, като се избягва образуването на пяна или ако има такава, тя се оставя да се диспергира. Времето между смесването на пробата и отпипетирането на тест-порцията не трябва да превишава три минути.

7.3. Приготвяне на основното разреждане (10-1)

1 ml от пробата (т. 7.2.2) се прехвърля със стерилна пипета (т. 4.2.3) в 9 ml разредител (т. 6.1), като се внимава пипетата и разредителят да не влязат в контакт. Температурата на разредителя трябва да бъде приблизително равна на температурата на пробата с мляко. Съдържанието на основното разреждане се размесва внимателно с миксер (т. 4.1.9) за около 5 - 10 секунди. Получава се първоначално разреждане 10-1.

7.4. Приготвяне на следващи десетократни разреждания

За получаването на десетократни разреждания 1 ml от основното разреждане (т. 7.3) се прехвърля чрез стерилна пипета (т. 4.2.3) в 9 ml от разредителя (т. 6.1), като се спазват указанията, дадени в т. 7.3. Получава се първоначално разреждане 10-2.

Приготвянето на допълнителни десетократни разреждания се извършва с нова стерилна пипета чрез повторение на същите манипулации до получаването на съответния очакван брой микроорганизми (т. 8.1).

7.5. Инокулиране на петриевите панички

1 ml от пробата и/или съответното десетократно разреждане се прехвърлят в петриева паничка (т. 4.2.4) със стерилна пипета (т. 4.2.3). На изследване подлежат най-малко две разреждания. Приготвят се две петри от всяко десетократно разреждане (т. 8.1).

7.6. Разливане в петриеви панички

Върху посевките във всяка петриева паничка се разливат от 15 до 18 ml от средата (т. 7.1). Непосредствено след разливането й хранителната среда се размесва с инокулума в петрито чрез кръгообразни движения, за да се получи равномерно разсейване на колониите след инкубация.

Времето между окончателното приготвяне на пробата мляко и смесването на разредителя със средата не трябва да превишава 15 минути.

Петритата се поставят на чиста, хладна хоризонтална повърхност до втвърдяване на съдържанието.

7.7. Инкубиране на петриевите панички

Петритата се поставят в инкубатор (т. 4.1.3, б), култивират се обърнати не повече от шест една върху друга, разделени помежду си и от стените и тавана на инкубатора, при температура 21 +/- 1 градуса C в продължение на 25 часа.

7.8. Изброяване на колониите

Изброяват се колониите в петрита, съдържащи не повече от 300 колонии.

Петритата се изследват на непряка светлина. За улесняване на изброяването може да се ползва лупа (т. 4.1.6) и/или броителна камера (т. 4.1.8). Специално внимание трябва да се обърне на частиците от утаечни вещества в петрита, които не трябва да се бъркат с колониите с формата на глава на топлийка (точковидни колонии). За различаване на колониите от чуждите тела съмнителните обекти се изследват внимателно при необходимост с помощта на лупа с по-голямо увеличение (т. 4.1.7).

Разлети или слети колонии се броят като една. Ако разливането е обхванало по-малко от една четвърт от петриевата паничка, изброява се броят на колониите в незасегната повърхност на петрито, след което се изчислява съответното число за цялото петри. Ако е покрита по-голяма част от една четвърт от повърхността на петрито, броенето не се извършва.

8. Изчисляване на резултатите

8.1. Използват се резултатите от всички петриеви панички, съдържащи между 10 и 300 колонии (вж. т. 8.3 и 8.4).

8.2. Броят на колонообразуващите единици на микроорганизмите (бактериалното число) на 1 ml пастьоризирано мляко се определя по формулата:

		S C
N	=	,
		(n1 + 0,1 n2)d

където:

S C е сумата от колониите, изброени съгласно т. 8.1.1;

(n1 + 0,1 n2) d - обемът на посятата проба, в която:

n1 - броят на петрита, отчетени от първото разреждане;

n2 - броят на петрита, отчетени от второто разреждане;

d - факторът на разреждане, от който са получени първите резултати.

Резултатът се обработва допълнително до две значими числа. Ако числото, което трябва да се закръгли, е 5, закръглява се броят вляво от 5, за да се получи четно число.

8.3. Ако резултатите показват брой на колониите само по-малък от 10, броят на микроорганизмите на милилитър се отчита като "по-малко от 10 x d на ml", като d е реципрочната стойност на фактора на най-ниското разреждане.

8.4. Ако резултатите отчитат само брой на колониите, по-голям от 300, при които изброяването е възможно, се прави изчисление на определения брой и се умножава по реципрочната стойност на фактора за разреждане. Резултатът се записва като "отчетен брой микроорганизми на милилитър".

Приложение № 12 към чл. 28, ал. 2

Изброяване на колиформи след култивиране при температура 30 градуса С

1. Приложение

Процедурата определя референтния метод за изброяване на колиформи в пастьоризираното мляко чрез изброяване на колониите след култивиране при температура 30 градуса C

2. Определение

Под "колиформи" се разбира бактерии, които при температура 30 градуса C образуват характерни или нехарактерни колонии, които усвояват лактоза с отделянето на газ при описаните условия на изследване.

3. Принцип

Определен обем от пробата с мляко се смесва с хранителната среда в петриеви блюда и се култивира при температура 30 градуса C в продължение на 24 часа. Изброяват се характерните колонии и при необходимост наличието на нехарактерни колонии се потвърждава чрез изследване на способността им да усвояват лактоза с отделяне на газ. Изчислява се броят на колиформите в 1 ml пастьоризирано мляко.

4. Апаратура и лабораторна стъклария

Стандартно лабораторно оборудване:

4.1. Апаратура

4.1.1. Сух стерилизатор, работещ при температура 170 до 175 градуса C.

4.1.2. Автоклав, работещ при температура 121 +/- 1 градуса C.

4.1.3. Инкубатор (термостат), поддържащ температура от 30 +/- 1 градуса C в целия си работен обем.

4.1.4. рH-метър с точност до +/- 0,1 pH единици и компенсатор на температурата.

4.1.5. Водна баня, работеща при температура 45 +/- 1 градуса C.

4.1.6. Йозе, платинено-иридиево или хром-никелово.

4.2. Лабораторна стъклария

4.2.1. Епруветки с подходящи запушалки и вместимост 20 ml за побиране на средата за потвърждаване (т. 5.2) и ферментационни епруветки на Дърхам (видалови епруветки) с подходящи размери.

4.2.2. Колби с вместимост 150 - 250 ml за твърдата селективна среда (т. 5.1).

4.2.3. Пипети (запушени с памук) от стъкло и стерилен синтетичен материал, със здрав край с номинален обем 1 - 10 ml и диаметър на изходния отвор 1,75 до 3 mm.

4.2.4. Петри от безцветно прозрачно стъкло или стерилен синтетичен материал с вътрешен диаметър на долното блюдо от около 90 - 100 mm и дълбочина най-малко 10 mm. Дъното трябва да бъде гладко, за да не пречи на точното изброяване на колониите.

4.2.5. Стерилизация на лабораторната стъклария

Лабораторната стъклария се стерилизира по един от следните начини:

а) в сух стерилизатор при температура от 170 до 175 градуса C за не по-малко от един час (т. 4.1.1);

б) в автоклав (т. 4.2.1) при температура 121 +/- 1 градуса C за не по-малко от 20 мин.

При стерилизация в автоклав трябва да се осигури добър достъп на парата до стъкларията. Така например, ако оборудването се стерилизира в контейнери, те не трябва да са плътно затворени, а колбите трябва да са с отворени капаци.

Стерилизираната в автоклав лабораторна стъклария се изсушава чрез вентилиране на парата.

Пипетите се стерилизират в сушилня на горещ въздух (т. 4.1.1).

5. Хранителна среда

5.1. Виолетово-червен лактозо-жлъчен агар (ВЧЛЖ- агар) - твърда селективна среда

Състав на хранителната среда: пептон - 7 g; дрождев екстракт - 3 g; лактоза (C12H22О11.H2О) - 10 g; натриев хлорид (NaCl) - 5 g; жлъчни соли - 1,5 g; неутрално червено - 0,03 g; кристалвиолет - 0,002 g; агар - 10 до 15 g в зависимост от желиращите качества на използвания агар; вода - 1000 ml.

Приготвяне на средата

Съставките се разтварят във водата и се оставят за няколко минути, след което енергично се разбъркват.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява pH на средата и при необходимост се коригира така, че след кипене да е равна на 7,4 +/- 0,1 при температура 25 градуса C, като се използва разтвор (с концентрация не по-малка от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

Средата се нагрява бързо до кипене, като периодично се разклаща, след което незабавно се разлива в количества от 100 до 150 ml в стерилни колби (т. 4.2.2) и се темперира на водна баня (т. 4.1.5) при температура от 45 +/- 1 градуса C.

Стерилността на средата се проверява по време на употребата й (вж. т. 6.4).

Средата е годна за употреба до три часа след приготвянето й.

5.2. Лактозо-жлъчен бульон с брилянтгрюн - среда за потвърждаване

Състав на хранителната среда: пептон - 10 g; лактоза (C12H22О11.H2О) - 10 g; суха говежда жлъчка - 20 g; брилянтгрюн - 0,0133 g; вода - 1000 ml.

Приготвяне на средата

Съставките на средата се разтварят във водата чрез нагряване до кипене.

С pH-метър (т. 4.1.4) се проверява pH на средата и при необходимост се коригира така, че след стерилизацията да е равна на 7,2 +/- 0,1 при температура 25 градуса C, като се използва разтвор (с концентрация не по-малка от 0,1 mol/l) на натриева основа или солна киселина.

Средата се разлива в количества от 10 ml в епруветки (т. 4.2.1), в които има поставени ферментационни епруветки на Дърхам, затварят се със запушалки и се стерилизират в автоклав (т. 4.1.2) при температура 121 +/- 1 градуса C в продължение на 15 мин.

След стерилизацията във ферментационните епруветки на Дърхам не трябва да има мехурчета.

Проверява се pH на средата.

Ако не се използва веднага, хранителната среда се съхранява на тъмно при температура между 0 и 5 градуса C до един месец след приготвянето й.

5.3. Готова суха хранителна среда

Хранителната среда (т. 5.1 и 5.2) може да е приготвена и от готова суха среда, като се спазват указанията на производителя. Проверява се pH, след което се разлива в съответните съдове, нагрява се до кипене или се стерилизира и съхранява по описаните в т. 5.1 и 5.2 начини.

6. Процедура

6.1. Хранителна среда

Средата (ВЧЛЖ- агар) се използва съгласно указаните в т. 5.1 начини.

6.2. Подготовка на пробата с мляко за изследване

Пробата с мляко се размесва добре чрез бързо 25-кратно обръщане на контейнера с пробата, за да се осигури възможно най-равномерно разпределение на микроорганизмите. Избягва се образуване на пяна или при наличието на такава тя се оставя да се диспергира. Времето между размесването на пробата и отпипетирането на тест-порцията не трябва да превишава 3 минути.

6.3. Инокулиране на петриевите блюда

Посяват се 3 ml от пробата с мляко (6.2) чрез прехвърляне на 1 ml във всяко от трите блюда (4.2.4) чрез стерилна пипета (4.2.3).

6.4. Разливане

Във всяко от инокулираните петри се разлива около 12 ml хранителна среда ВЧЛЖ-агар (т. 6.1).

Веднага след разливането й хранителната среда се размесва с инокулума в петрито чрез кръгообразни движения, за да се получи равномерно разсейване на колониите след инкубация.

Времето между окончателната подготовка на пробата с мляко и смесването на отпипетираната тест-порция със средата не трябва да превишава 15 мин.

За проверка на стерилността се приготвя контрола от неинокулирано петриево блюдо с 12 ml ВЧЛЖ- агар, използван за посетите петри.

Петритата се оставят върху чиста и хладна хоризонтална повърхност до втвърдяване на средата в тях.

След пълното втвърдяване върху повърхността на инокулираната среда се наслоява нов слой от не по-малко от 4 ml ВЧЛЖ-агар (т. 6.1), който се оставя да се втвърди отново.

6.5. Инкубиране на петриевите блюда

Петритата се поставят в инкубатор (т. 4.1.3). Култивират се обърнати с дъното нагоре не повече от шест на брой едно върху друго, разделени помежду си и от стените и тавана на инкубатора, при температура 30 +/- 1 градуса C в продължение на 24 +/- 2 часа.

6.6. Изброяване на колониите

6.6.1. Изброяват се колиформите в петрите, чийто брой е от 10 до 150. Заобикалящият ги преципитат е с червена зона.

6.6.2. Ако всички или някои колонии покажат нехарактерна реакция (например различават се по цвят, размер или образуването на преципитат от типични колонии) се извършва тест за потвърждаване (т. 6.7).

6.7. Тест за потвърждаване

Тестът за потвърждаване се извършва след определяне наличието на условията в т. 6.6.2 върху подходящ брой - три или пет например, нехарактерни колонии чрез посяване с йозе (т. 4.1.6) в епруветки на лактозо-жлъчен бульон с брилянтгрюн (т. 5.2), които се култивират при температура 30 +/- 1 градуса C в продължение на 24 +/- 2 часа.

За колиформи се приемат колонните, които отделят газ във ферментационните епруветки на Дърхам.

7. Изчисляване на резултатите

7.1. Отчитат се посевките (вж. т. 7.4) от петрита, които съдържат повече от 150 колонии.

7.2. При извършване на тест за потвърждаване броят на колиформните колонии се изчислява въз основа на процента на доказаните колиформни колонии.

7.3. Броят на колиформите в 1 ml пастьоризирано мляко се определя по формулата:

S C

,

n

където:

S C е общият брой на колониите на колиформните бактерии (вж. т. 7.1 във връзка с т. 7.2), получен при изследване на пробата мляко (3 ml);

n - количеството милилитри от изследваната проба (т. 6.3) (3 ml).

За изразяване на резултата при наличието само на повече от 100 колонии броят на колиформите се обработва до две значими числа. Когато числото, което се закръглява, е 5, числото вляво от него се закръглява така, че да се получи четно число.

7.4. Ако за посевките се отчита само брой на колониите, по-голям от 150, резултатът се записва като "Отчетен брой на колониите в 1 ml".

Приложение № 13 към чл. 28, ал. 2

Доказване на патогенни микроорганизми

1. Приложение

Процедурата определя указанията за проверка на пастьоризираното мляко за наличие на патогенни микроорганизми.

2. Определение

На изследване подлежат бактериалните видове, които са най-често срещани в предаваните чрез храни болести.

Ако са изпълнени изискванията за броя на микроорганизмите при температура 30 градуса C и 21 градуса C, колиформите и фосфатазата, патогенността на микроорганизмите се доказва допълнително само при съмнение, че млякото е добито от животни, които са хранени със заразена храна.

3. Процедура

Използват се ISО-стандартите за изследване на топлинно преработени млечни продукти по отношение наличие на патогени.

4. Протокол от изследването

Резултатите от изследването на всеки отделен патогенен микроорганизъм се записват по следния начин:

Брой в ml мляко, "наличие" или "отсъствие" на микроорганизми в задължителния за използвания метод обем пастьоризирано мляко. Протоколът трябва да съдържа ясно описание на използвания метод.