Държавен вестник, брой 110 от 21.XII

Отменена с § 5 от заключителните разпоредби на Наредба № 110 от 18 септември 2006 г. за специфични изисквания за осъществяване на официален контрол за трихинела в месо - ДВ, бр. 83 от 13 октомври 2006 г., в сила от 14.11.2006 г.

Чл. 1. (1) С тази наредба се определят мерките за профилактика и контрол на трихинелозата по животните.

(2) Профилактика и контрол на трихинелоза се извършва чрез:

1. изследване (трихинелоскопиране) на прясно месо от животни, които могат да бъдат носители на трихинела;

2. маркиране на трихинелоскопирано месо;

3. унищожаване на трихинели в заразено месо чрез:

а) замразяване;

б) изгаряне;

в) техническо оползотворяване.

Чл. 2. (1) Собствениците на животни са длъжни:

1. да декларират в кметствата вида и броя на притежаваните от тях животни;

2. да регистрират животновъдните си обекти в регионалната ветеринарномедицинска служба (РВМС);

3. да осигуряват необходимите зоохигиенни условия за отглеждане на животни, като:

а) оградят, ежедневно почистват по механичен начин и дезинфекцират помещенията и дворовете към тях;

б) периодично извършват дератизация;

в) обезвреждат чрез компостиране или дезинфекция тора и торовата течност;

г) не изхранват животните с кухненски, кланични и отпадъци от сметища;

д) не отглеждат животни на сметища;

е) след клане на животни за собствена консумация уведомяват ветеринарния лекар от ветеринарния участък или от районната ветеринарна лечебница и представят проби от диафрагма за изследване за трихинели.

(2) Ловците са длъжни да предават в екарисажите или да загробват на дълбочина не по-малко от 1 м труповете на убитите диви животни в случаите, когато оползотворяват само кожите, но не и месото.

Чл. 3. (1) Трихинелозата се открива чрез:

1. трихинелоскопско изследване;

2. изследване с изкуствен стомашен сок;

3. изследване чрез смилане на сборни проби с изкуствен стомашен сок;

4. изследване чрез механично смилане на сборна проба (техника на седиментация);

5. изследване чрез механично смилане на обща проба (филтърна техника на изолиране);

6. изследване чрез "оголване" с магнит за смилане на сборна проба;

7. изследване чрез автоматично смилане на сборни проби по 35 г.

(2) На изследване по ал. 1 подлежи месото на домашни и диви свине, мечки, нутрии, еднокопитни и други животни, които могат да бъдат носители на трихинели.

(3) Изследванията по ал. 1 се извършват по методиките, посочени в приложение № 1.

(4) Месото от домашни и диви свине се изследва чрез трихинелоскопско изследване или чрез смилане с изкуствен стомашен сок.

(5) Конското месо се изследва чрез методиките, посочени в приложение № 2.

Чл. 4. Трихинелите се унищожават чрез замразяване на месото по една от методиките, посочени в приложение № 3.

Чл. 5. (1) Трихинелите се изследват в одобрени от Националната ветеринарномедицинска служба (НВМС) лаборатории към кланиците.

(2) Лабораториите за изследване на трихинели трябва да имат:

1. заключваща се стая с гладки стени, облицовани със светли плочки или боядисани с блажна боя на височина 2 м, с подходящо оборудване за подготовка на мускулните срезове;

2. отделно помещение за подготовка на пробите за всеки метод на изследване;

3. подходящо помещение за трихинелоскопа с възможности за затъмняване;

4. съоръжения, осигуряващи вентилация и поддържане на температура на помещението не по-висока от 25 градуси С;

5. подходящо естествено или изкуствено осветление, което не променя цветовете; да се избягва директна слънчева светлина;

6. подходящо съоръжение за почистване и дезинфекция на ръцете в помещението за подготовка;

7. хладилници за съхранение на месните проби;

8. миялно помещение за почистване и дезинфекция на пособията за изследване (съдове за проби, компресорни стъкла, ножове и ножици) със:

а) водонепромокаема подова настилка, устойчива на гниене и лесна за почистване и дезинфекция;

б) гладки стени, облицовани със светли плочки или боядисани с блажна боя на височина най-малко 2 м;

9. мивки с гореща и студена питейна вода, снабдени с препарати за почистване и дезинфекция, както и с кърпи за еднократна употреба;

10. водоустойчиви неръждаеми съдове с херметически затварящи се капаци за събиране на пробите след изследване, които не позволяват достъп на неупълномощени лица до тях;

11. подходящо съоръжение за предпазване от насекоми, гризачи и др.;

12. стаи за преобличане, стаи за почивка и санитарен възел;

13. съоръжение за отстраняване на отпадъчната вода, което отговаря на изискванията към кланиците.

(3) В лабораториите се спазват следните изисквания:

1. помещенията им се поддържат винаги чисти;

2. съоръженията и инструментите в лабораториите се поддържат в добро състояние, почистват се и се дезинфекцират неколкократно през работния ден и след приключването му;

3. използва се само питейна вода;

4. не се допускат животни.

(4) Пробите от месо се вземат веднага след клането на животните и се изследват незабавно в лабораторията за трихинелоза в кланицата.

(5) Не се допуска изследване за трихинелоза на животни, заклани в кланицата, в други лаборатории извън кланицата.

Чл. 6. Изследванията за трихинели се извършват с трихинелоскопи, които отговарят на следните изисквания:

1. силна светлочувствителност, позволяваща точни резултати и когато в помещението не е напълно затъмнено;

2. светлинен източник - прожекторна крушка от 100 W/12/V;

3. подходящо увеличение:

а) нормално работно увеличение - 50 пъти;

б) 80 до 100 пъти увеличение за по-прецизна преценка на обекти, които не могат да се различават ясно при нормално работно увеличение;

4. сила на проявяването, която позволява получаването на ясно изразена картина с добре определен цвят при всяко увеличение;

5. механизъм за включване/изключване, като всяка смяна на увеличението се придружава от автоматична настройка на яркостта на образа;

6. увеличение на контраста - кондензорът е снабден с ирисова диафрагма (бленда), осигуряваща увеличаването на контраста за по-близък оглед на трудните случаи; ирисовата бленда да е леснодостъпна за работа;

7. бързо и точно фокусиране посредством копче за настройка и контролно лостче;

8. регулиране на волтажа, за да може яркостта да се настройва по желание;

9. автоматична блокировка, която не позволява неволно изместване на пробата;

10. свободен достъп до прожекционния екран;

11. прожекционен екран с диаметър най-малко 54 см, високи възможности на рефлектора, трайност, възможност за демонтиране и лесно почистване;

12. да са поставени на удобно и достъпно място.

Чл. 7. (1) Лицата, които работят в лабораториите по чл. 5 или вземат проби за изследване за трихинели:

1. представят здравна книжка при постъпване на работа, която се заверява ежегодно и всеки път, когато това е необходимо, за да удостовери годността на лицето за работа;

2. отговарят на следните изисквания:

а) носят чисти работни дрехи и мият ръцете си няколко пъти в работния ден и след всяка почивка;

б) изпълняват точно и в срок методиките за изследване на трихинелозата;

в) водят дневник, в който отразяват извършените изследвания;

г) издават протокол с резултатите от извършените изследвания за трихинелоза.

(2) Лицата по ал. 1 не се допускат в лабораториите и за вземане на проби, когато:

1. са болни или съмнително болни за заразни болести или са бацилоносители на:

а) коремен тиф, паратиф А и Б, инфекциозен ентерит (салмонелоза), дизентерия, инфекциозен хепатит, скарлатина;

б) туберкулоза;

в) заразни заболявания по кожата;

2. имат рани и превръзки на ръцете, с изключение на непромокаема превръзка, покриваща рана, която не е гнойна;

3. извършват друга дейност, чрез която има опасност да бъдат пренесени микроорганизми и да бъде заразено месото.

(3) На лицата по ал. 1 се осигурява почивка на кратки интервали през работното време за избягване на умората и нейните последици.

Чл. 8. (1) Право да извършват трихинелоскопиране на месо имат държавни ветеринарни лекари или ветеринарни техници под контрола на държавен ветеринарен лекар.

(2) Държавният ветеринарен лекар при откриване на трихинели в изследваното месо го забранява и в срок 24 часа изпраща писмено съобщение до РВМС, от чийто район произхождат заразените животни, и до Главно управление на НВМС.

Чл. 9. (1) Месото от животните, посочени в чл. 3, ал. 2, се изследва за трихинели и се маркира преди:

1. търговия, преработване или консумация;

2. влагането му за производство на храни за кучета и котки.

(2) При отрицателен резултат от изследването здравната маркировка се поставя незабавно.

Чл. 10. (1) Месо от животни, които могат да бъдат носители на трихинели, се разрешава за консумация, при условие че резултатът от трихинелоскопирането е отрицателен.

(2) Внос на месо от животни, които могат да бъдат носители на трихинели, се разрешава, ако резултатът от изследването по една от методиките на тази наредба е отрицателен.

Чл. 11. Когато при изследването се установи наличие на трихинели:

1. месото, субпродуктите и месните продукти от трихинелозно животно се подлагат на техническо оползотворяване или се унищожават на място чрез изгаряне в присъствието на държавен ветеринарен лекар;

2. сланината се претопява;

3. вътрешните тлъстини се използват без ограничение;

4. кожите от трихинелозни животни се използват след отделяне на подкожната мускулна тъкан;

5. отпадъците от кожите се изпращат за техническо оползотворяване.

Чл. 12. (1) Маркирането на трихинелоскопирано месо се провежда под непосредствения контрол на държавен ветеринарен лекар.

(2) Държавният ветеринарен лекар съхранява инструменти, печати и марки и ги предоставя на лицата по чл. 8, ал. 1 само за времето, докато трае маркирането.

Чл. 13. (1) Маркирането се извършва:

1. с намастилен или горещ печат;

2. чрез поставяне на марка.

(2) Печатът е кръгъл с диаметър 2,5 см и открояваща се главна буква "Т" с височина 1 см и широчина 0,2 см, разположена в центъра му. Под буквата "Т" е изписана абревиатурата BG.

(3) Марката е кръгла, изработена от здрав материал, използва се еднократно, отговаря на изискванията по ал. 2 и се поставя на всяко парче или труп.

Чл. 14. Маркирането се извършва:

1. на трупове - от вътрешната страна на бута;

2. на глави - с намастилен или горещ печат, отговарящ на изискванията по чл. 13, ал. 2.

От всяка проба, взета от парчетата месо, трихинелоскопиращият инспектор изрязва четири парченца с размер на овесена ядка, което прави общо 12 парченца.

Изследването за трихинелоза се провежда така, че всеки препарат да се разглежда бавно и внимателно. Ако при изследването се забележат съмнителни места, чиято природа категорично не може да се потвърди и под най-силното увеличение на трихинелоскопа, те се проверяват и на микроскоп.

Изследването под микроскоп се провежда така, че всеки препарат да се разглежда бавно и внимателно под увеличение 30 до 40 пъти.

При несигурен резултат изследването продължава върху още мускулни късове и препарати при необходимост с помощта на по-силно увеличение, докато се получи необходимата информация.

Изследването под трихинелоскоп се провежда най-малко 3 минути.

Изследването под трихинелоскоп се провежда най-малко 6 минути в случаи с мускулни късове-заместители, взети от ребрената част или гръдната част на диафрагмените стволове, езика, масетерите или междуребрените мускули.

Минималното време, фиксирано за изследване, не включва времето, необходимо за вземане на проби и за подготвяне на препарати.

Трихинелоскопиращият не трябва да изследва повече от 840 парченца на ден, макар и по изключение да може да проконтролира и до 1050.

II. Изследване с изкуствен стомашен сок

1. Апаратура и материали:

- нож за вземане на проби;

- малки номерирани съдове с капак за съхраняване на пробите, по възможност до повтаряне на изследването;

- термостат;

- стъклена конусовидна фуния (2 - 3 л) със стойка, свързваща гумена тръбичка и скоби за прикачване на свързващата тръбичка;

- пластмасово сито (с диаметър приблизително 18 см и мрежа приблизително 1 мм);

- малка епруветка със запечатан край;

- епруветка;

- стъклена разграфена паничка;

- месомелачка;

- стереомикроскоп (увеличение 14 на 40 пъти) с подходящ светлинен източник;

- изкуствен стомашен сок, приготвен по следния начин: 10 г пепсин (80 m/г FIP: Международна федерация по фармацевтика), 5 мл НСI (солна киселина) (най-малко 37 %) и се допълва до 1 литър с чешмяна вода.

2. Събиране на мускулни късове

При цели трупове се взема проба от най-малко 20 г от диафрагмените стволове при прехода към сухожилната част. При липса на диафрагмени стволове се взема мускулен къс от най-малко 20 г от ребрената част или гръдната част на диафрагмата, или от езика, масетерите или междуребрените мускули.

За парчета месо се взема проба (най-малко 20 г) от скелетния мускул без тлъстина и по възможност близко до костите и сухожилията.

3. Методика

За изследване на сборна проба от 10 прасета се приготвя по 10 г къс от всяка индивидуална 20-грамова проба, а останалите 10 г се запазват в случай, че се наложи допълнително изследване на индивидуални проби.

В сборната проба се комбинират 10 къса по 10 г; тя се смила в месомелачка (с отвор на решетката 2 мм) и се поставя в сито, подложено с пласт марля.След това ситото се поставя в конусовидна фуния, свързана с гумена тръбичка към малка епруветка със запечатан край; фунията се пълни с изкуствен стомашен сок, докато се покрие напълно материята за анализ. Съотношението на материята за анализ спрямо изкуствения стомашен сок е приблизително 1:20 до 1:30.

След 18 - 20 часа инкубация при 37 - 39 градуси С епруветката се откачва и отстранява.След внимателно засмукване на повърхностния слой течност утайката на дъното на епруветката внимателно се излива в разграфената паничка. След това се изследва под стереомикроскоп за наличие на трихинели при увеличение 20 до 40 пъти.

При положителен или съмнителен резултат от изследването на сборната проба останалите единични късове се изследват индивидуално след добавяне на още 20 г от всяко прасе, а при месо - добавка от 20 г, взети от всяко парче, съобразно т. 2.

III. Изследване чрез смилане на сборни проби с изкуствен стомашен сок

1. Апаратура и реактиви:

- ножче и пинсети за вземане на мускулни късове;

- месомелачка с отвор на решетката с диаметър 2 - 3 мм;

- ерленмайерова колба от 3 л с гумена или памучна запушалка;

- конусовидна разделителна фуния с обем 2000 мл;

- обикновена стойка с А-основа с дължина приблизително 28 см и вертикално стебло 80 см;

- пръстен с диаметър приблизително 10 - 11 см, който се прикрепва към стойката;

- скоба с плоски клеми (23 x 400 мм), която може да се прикрепва към стойката с помощта на двоен куплунг;

- сито (размер на мрежата 177 микрона) с външен диаметър 11 см, прикрепено с мрежа от месинг или неръждаема стомана;

- фуния с вътрешен диаметър не по-малък от 12 см;

- стъклени мерителни цилиндри от 100 мл;

- стереомикроскоп (увеличение 15 x 40) с подходящ светлинен източник или трихинелоскоп с хоризонтална маса за компресора с подходящ светлинен източник;

- при работа с трихинелоскоп се използва легенче за броене на ларви, направено от акрилни плочки с дебелина 3 мм с дъно с размери 180 x 40 мм, разграфено на квадратчета, страни с размери 230 x 20 мм и с край 40 x 20 мм; дъното и краищата се вмъкват между стените, така че да се образува легенче с две миниатюрни дръжки от двете страни; горната част на дъното се вдига на 7 до 9 мм над основата на рамката, образувана от страните и краищата; частите се фиксират с лепило, подходящо за материала;

- няколко петриеви панички с диаметър 9 см (когато се използва стереомикроскоп), маркирани с остър инструмент от долната страна на квадратчетата с размери 10 x 10 кв. мм;

- няколко 10-литрови кофи, които се използват при обеззаразяване на апаратурата и на останалия изкуствен стомашен сок в случай на положителни резултати (напр. обработката с формалин);

- концентрирана (37 %) солна киселина;

- активност на пепсина: 1:10 000 NF (национална формулировка на САЩ), съответстваща на 1:12 500 ВР (по Британската фармакопея), съответстваща на 2000 FIР (международна федерация по фармация);

- няколко таблички, на които могат да се поставят 50 проби с тегло приблизително по 2 г;

- везни с точност до 0,1 г.

2. Събиране на мускулни късове

При цели трупове се взема мускулен къс приблизително 20 г от диафрагмените стволове при прехода към сухожилната част. При липса на диафрагмени стволове се взема мускулен къс с размер най-малко 20 г от ребрената част на гръдната част на диафрагмата, от езика, масетерите или междуребрените мускули.

За късове месо се взема проба приблизително 2 г от скелетния мускул с малко тлъстина и по възможност близо до костите и сухожилията.

3. Методика

Пълна вана (100 проби едновременно)

От всяка от 100-те индивидуални проби от прасетата се вземат по 1 г приблизително. Сборната проба се минава веднъж през месомелачката.

Смляното месо се поставя в 3-литрова ерленмайерова колба заедно със 7 г пепсин, приблизително 2 л чешмяна вода, затоплена до около 40 - 41 градуси С и 25 мл концентрирана солна киселина. Сместа се разклаща, за да се разтвори пепсинът. рН на разтвора трябва да бъде около 1,5 до 2.

За смилането ерленмайеровата колба се термостатира при 40 - 41 градуси С за около четири часа. По време на термостатирането колбата периодично се разклаща най-малко два пъти на час.

Изкуственият стомашен сок трябва да се филтрира през сито в конусовидна двулитрова разделителна фуния и да се остави в покой на стойката за най-малко един час.

Общ обем от приблизително 45 мл се прекарва през мерителен цилиндър и се разделя в три петриеви панички, дъната на които са разграфени на квадратчета, по 15 мл във всяка паничка.

Всяка петриева паничка подробно се разглежда за ларвени трихини под стереомикроскоп.

Когато се използват легенчета за броене на ларвите, обемът от 45 мл се разпределя между две такива легенчета и се разглежда под трихинелоскоп. Ларвите приличат на добре различими организми в утайката и често, когато водата е хладка, могат да се наблюдават движения, подобни на свиване и разпускане на "спиралата".

Разтворите по възможност се изследват веднага щом са готови, като изследването в никакъв случай не трябва да се отлага за следващия ден.

Ако разтворите са мътни или не се изследват в рамките на 30 мин. от момента на приготвянето им, те се избистрят по следния начин. Последната проба от 45 мл се излива в мерителен цилиндър и се оставя да престои 10 мин. В края на този период от разтвора се изваждат 30 мл от повърхностния слой чрез засмукване и останалите 15 мл се доливат до 45 мл с чешмяна вода. След още 10 минути утаяване се изваждат чрез засмукване още 30 мл от повърхностния слой и останалите 15 мл се изливат за изследване в петриева паничка или в легенче за броене на ларви. Мерителният цилиндър се изплаква с 10 мл чешмяна вода и тази течност се добавя за изследване към мострата в петриевата паничка или в легенчето за броене на ларви.

Вани за по-малко от 100 проби

До 15 единични проби могат да се добавят към общата вана от 100 проби и да се изследват заедно с тези проби. Ако се изследват повече от 15 проби или по-малко от 100 проби, изкуственият стомашен сок трябва пропорционално да се намали. При положителен или съмнителен резултат след изследването на една сборна проба от всяко прасе се взема нова 20-грамова проба в съответствие с т. 2. Двадесетграмовите проби от петте прасета се събират във вана и се изследват по описаната методика. По този начин се изследват проби от 20 групи от пет прасета. Когато в една сборна проба от пет прасета се открият трихинели, се събират още 20-грамови проби от отделни прасета от групата и всяка проба се изследва отделно по описаната методика.

IV. Изследване чрез механично смилане на сборна проба/техника на седиментация

1. Апаратура и реактиви:

- нож или ножица за вземане на мускулни късове;

- таблички с маркировка от 50 квадратчета на всяка за пробите от месо с тегло приблизително 2 г;

- лабораторен миксер (Stomacher) термомодел 3500;

- пластмасови торбички, подходящи за лабораторния миксер (Stomacher);

- конусовидни разделителни фунии с обем 2 л, за предпочитане с тефлонови безопасни щекери;

- стойки, пръстени и скоби;

- сита с размер на мрежата 177 m, външен диаметър 11 см от неръждаема стомана;

- фунии с вътрешен диаметър не по-малък от 12 см за крепене на ситата;

- стъклени мерителни цилиндри от 100 мл;

- съд от 25 мл;

- бехер с обем 3 л;

- лъжица или стъклена пръчка за разбъркване на изкуствения стомашен сок в стъкленицата;

- пластмасова спринцовка и тръбичка за засмукване;

- мерителна лъжичка за 6 г;

- термометър с точност до 0,5 градуси С в обсег 1 - 100 градуси С;

- вибратор;

- реле с превключвател на интервал 1 минута;

- трихинелоскоп с хоризонтална маса или стереомикроскоп с подходящ светлинен източник;

- легенче за броене на ларвите (когато се използва трихинелоскоп), направено от акрилни плочки с дебелина 3 мм с дъно с размери 180 x 40 мм, разграфено на квадратчета, страни с размери 230 x 20 мм и с край 40 x 20 мм; дъното и краищата се вмъкват между стените, така че да се образува легенче с две миниатюрни дръжки от двете страни; горната част на дъното се вдига на 7 до 9 мм над основата на рамката, образувана от страните и краищата; частите се фиксират с лепило, подходящо за материала;

- няколко петриеви панички с диаметър 9 см (когато се използва стереомикроскоп), маркирани с остър инструмент от долната страна на квадратчетата с размери 10 x 10 кв. мм;

- няколко 10-литрови кофи, които се използват при обеззаразяване на апаратурата и на останалия изкуствен стомашен сок в случай на положителни резултати (напр. при обработката с формалин);

- разтвор на 17,5 % солна киселина;

- активност на пепсина: 1:10 000 NF (национална формулировка на САЩ), съответстваща на 1:12 500 ВР (по Британската фармакопея), съответстваща на 2000 FIР (международна федерация по фармация);

- няколко таблички, на които могат да се поставят 50 проби с тегло приблизително по 2 г;

- везни с точност до 0,1 г.

2. Събиране на мускулни късове

При цели трупове се взема мускулен къс приблизително 20 г от диафрагмените стволове при прехода към сухожилната част. При липса на диафрагмени стволове се взема мускулен къс от най-малко 20 г от ребрената част на гръдната част на диафрагмата, от езика, масетерите или междуребрените мускули.

За късове месо се взема проба приблизително 2 г от скелетния мускул с малко тлъстина и по възможност близо до костите и сухожилията.

3. Методика

Процедура на смилането

Пълна вана (100 проби едновременно). Лабораторният миксер (Stomacher 3500) се прикрепва с двойна пластмасова торбичка с настройка на температурата 40 - 41 градуси С. Литър и половина вода, предварително затоплена до 32 - 35 градуси С, се излива във вътрешната пластмасова торбичка и водата се затопля до 40 - 41 градуси С. След това към водата в миксера се добавят 25 мл от 17,5 % НСI. Добавят се 100 проби, всяка по 1 г приблизително, които се вземат от индивидуалните проби в съответствие с т. 2. Добавят се 6 г пепсин; този ред на добавяне се спазва строго, за да се избегне разлагането на пепсина. Миксерът се оставя "да смели" съдържанието на торбичката в продължение на 25 минути. Пластмасовата торбичка се изважда от миксера и изкуственият стомашен сок се филтрира през ситото в една 3-литрова стъкленица. Пластмасовата торбичка се изплаква с приблизително 100 мл вода, която пък се използва за изплакване на ситото и накрая се добавя към филтрата в стъкленицата. До 15 единични проби могат да се добавят към обща вана от 100 проби и да се изследват заедно с тези проби.

По-малки вани с по-малко от 100 проби. Лабораторният миксер (Stomacher 3500) се прикрепва с двойна пластмасова торбичка с настройка на температурата 40 - 41 градуси С. Приготвя се изкуствен стомашен сок, като се смесят 1,5 л вода и 25 мл солна киселина от 17,5 %, добавят се 6 г пепсин и всичко се смесва при температура 40 - 41 градуси С; този ред на добавяне стриктно се спазва, за да се избегне разлагането на пепсина. От изкуствения стомашен сок се измерва 15 мл на 1 г проба (напр. за 30 проби желаният обем е 30 x 15 мл или 450 мл) и се пренася към вътрешността на двете пластмасови торбички заедно с пробите месо от около 1 г, взети от всяка от индивидуалните проби в съответствие с т. 2. Вода с температура около 41 градуси С се долива във външната торбичка до общ обем 1,5 л в двете торбички. След това миксерът се оставя да мели съдържанието на торбичката около 20 минути. Пластмасовата торбичка се изважда от миксера и изкуственият стомашен сок се филтрира през ситото в 3-литрова стъкленица. Пластмасовата торбичка се изплаква с около 100 мл вода, която след това се използва за изплакване на ситото и накрая се добавя към филтрата в стъкленицата.

Възстановяване на ларвите чрез седиментация. Лед (300 до 400 ледени снежинки, люспи или натрошен лед) се добавя към изкуствения стомашен сок, докато той стигне до обем около 2 л; след това стомашният сок се разбърква до стопяване на леда; при по-малки вани (вж. т. 3.1.2) количеството лед съответно се намалява.

Охладеният изкуствен стомашен сок се пренася в 2-литрова делителна фуния, снабдена с вибратор в допълнителна скоба.

Извършва се седиментация за 30 мин., през което време седиментационната фуния вибрира с прекъсвания, т.е. една минута вибрация, следвана от една минута пауза.

След 30 мин. 60 мл проба от утайката бързо се влива в мерителен цилиндър от 100 мл (след употреба фунията се изплаква със сапунен разтвор).

60 мл проба се оставя най-малко 10 минути, след което повърхностният слой трябва да се засмуче, като се остави обем от 15 мл за изследване за наличие на ларви.

За засмукването може да се използва спринцовка за еднократна употреба, снабдена с пластмасова тръбичка с дължина, позволяваща да останат в мерителния цилиндър 15 мл.

Останалите 15 мл се изливат в легенчето за броене на ларви или в две петриеви панички и се изследват респ. с трихинелоскоп или със стереомикроскоп.

Смлените проби се изследват веднага щом са готови; изследването не трябва в никакъв случай да се отлага за следващия ден.

Ако изкуственият стомашен сок е мътен или не се изследва в рамките на 30 мин. от подготовката му, той се избистря по следния начин. Последната проба от 60 мл се излива в мерителен бехер и се оставя да престои 10 мин. В края на този период от разтвора се изваждат чрез засмукване и останалите 15 мл се доливат до 45 мл с чешмяна вода. След още 10 мин. утаяване се изваждат чрез засмукване още 30 мл от повърхностния слой и останалите 15 мл се изливат за изследване в петриева паничка или в легенче за броене на ларви. Мерителният цилиндър се изплаква с 10 мл чешмяна вода и тази течност се добавя за изследване към мострата в петриевата паничка или в легенчето за броене на ларви.

При положителен или съмнителен резултат след изследването на една обща проба от всяко прасе се взема нова 20-грамова проба в съответствие с т. 2. Двадесетграмовите проби от петте прасета се събират във вана и се изследват по описаната методика. По този начин ще бъдат изследвани проби от 20 групи от по пет прасета. Когато в една събрана проба от пет прасета се открият трихинели, се събират още 20-грамови проби от другите прасета в групата и всяка се изследва по отделно по описаната методика.

V. Изследване чрез механично смилане на обща проба ("филтърна техника на изолиране")

1. Апаратура и реактиви - посоченитe в методика на IV, т. 1.

Допълнителни съоръжения:

- еднолитрова гелманова фуния, комплектувана с държач на филтъра (диаметър 45 мм);

- филтрови дискове, които се състоят от кръгла мрежа от неръждаема стомана с отвор 35 m (диаметърът на диска трябва да бъде 45 мм, а вътрешният - 38 мм), кръглата мрежа се поставя между два гумени пръстена и се залепва към тях с помощта на двукомпонентно лепило, подходящо за двата материала;

- е колба с обем 3 л, снабдена със странична тръбичка за засмукване;

- филтър-помпа;

- пластмасови торбички с обем най-малко 80 мл;

- съоръжение за запечатване на торбичките;

- активност на ренилазата: 1:150 000 сокслетови единици на грам.

2. Събиране на мускулни късове - вж. методика IV, т. 2.

3. Методика

Процедура на смилането

Пълни вани (100 проби наведнъж) - вж. методика IV, т. 3

По-малки вани с под 100 проби - вж. методика IV, т. 3

Възстановяване на ларви чрез филтриране: лед (300 - 400 г ледени снежинки, люспи или натрошен лед) се добавя към изкуствения стомашен сок, докато той стигне до обем около 2 л; при по-малки вани (вж. т. 3.1.2) количеството лед трябва съответно да се намали;

- гелманова фуния с държач за филтър, филтъров диск (антибактериален филтър), надставен с ерленмайрова колба, която е свързана с филтърна помпа;

- след това изкуственият стомашен сок се излива в гелманова фуния и се филтрира; към края на филтрирането преминаването на стомашния сок през филтъра може да се подпомогне, като се приложи засмукване с филтровата помпа; засмукването трябва да спре преди да се пресуши филтърът, т.е. когато във фунията останат 2 - 5 мл от течността;

- когато се филтрира целият изкуствен стомашен сок, филтърният диск се отстранява и се поставя в пластмасова торбичка с обем 80 мл заедно с 15 - 20 мл разтвор от ренилаза; този разтвор се получава, като се добавят 2 мг ренилаза към 100 мл чешмяна вода;

- пластмасовата торбичка се запечатва два пъти и се поставя в миксера между вътрешната и външната торбичка;

- след това миксерът се оставя да мели 3 мин., напр. докато работи в пълна или непълна вана;

- след 3 мин. пластмасовата торбичка заедно с филтърния диск и разтвора от ренилаза се отстраняват от миксера и се отваря с ножичка; течното съдържание се излива в легенче за броене на ларви; торбичката се изплаква с 5 - 10 мл вода, която след това се добавя към легенчето за изследване под трихинелоскоп или към петриевата торбичка за изследване под стереомикроскоп;

- смлените проби се изследват веднага щом са готови; изследването не трябва в никакъв случай да се отлага за следващия ден.

Филтърните дискове никога не се използват, ако не са абсолютно чисти. Нечистите дискове никога не се оставят да изсъхнат. Филтърните дискове се почистват, като се оставят за една нощ в разтвор от ренилаза. Преди да се използват, те се изплакват в пресен разтвор от ренилаза, като се използва миксер.

В случай на положителен или съмнителен резултат след изследването на обща проба се вземат нови 20 г проба от всяко прасе в съответствие с т. 2. Пробите от 20 г от пет прасета се събират във вана и се изследват по описаната методика. Когато се открият трихинели в една обща проба от пет прасета, се вземат нови 20-грамови проби от отделните прасета в групата и всяка поотделно да се изследва по описаната методика.

VI. Изследване чрез "оголване" с магнит за смилане на сборна проба

1. Апаратура и реактиви:

- нож и пинсети за рязане на мускулни късове;

- таблички, разграфени на 50 квадратчета всяка, за проби месо по около 2 г всяка;

- миксер "Мулинет";

- магнитни бъркалки с термостатно контролиран котлон и бъркалки с тефлоново покритие с дължина около 5 см;

- конусовидни делителни фунии с обем 2 л;

- стойки, пръстени и скоби;

- сита с размер на мрежата 177 m, външен диаметър 11 см от неръждаема стоманена мрежа;

- фунии с вътрешен диаметър не по-малък от 12 см за поддържане на ситата;

- стъкленица с обем 3 л;

- мерителни цилиндри с обем около 50 мл или центрофужни тръби;

- трихинелоскоп с хоризонтална плоча или стерео-микроскоп с подходящ светлинен източник;

- легенче за броене на ларви (когато се използва трихинелоскоп): легенчето е направено от акрилни плочки с дебелина 3 мм, както следва:

а) дъното на легенчето трябва да бъде 180 x 40 мм, разграфено на квадратчета;

б) страните трябва да са 230 x 20 мм;

в) краят трябва да е 40 x 20 мм; дъното и краищата трябва да се вмъкват между страните, като по този начин от двете страни се образуват две миниатюрни дръжки; горната част на дъното се повдига 7 - 9 мм от основата на рамката, образувана от страните и краищата; частите се фиксират с лепило, подходящо за материала;

- няколко петриеви панички с диаметър 9 см (когато се използва стереомикроскоп), от долната страна разграфени с остър инструмент на квадратчета 10 x 10 мм за изследване;

- алуминиево фолио;

- солна киселина 25 %;

- активност на пепсина:1:10 000 NF (национална формулировка на САЩ), съответстваща на 1:12 500 ВР (по Британската фармакопея), съответстваща на 2000 FIР (международна федерация по фармация);

- чешмяна вода, затоплена до 46 - 48 градуси С;

- няколко 10-литрови кофи, които се използват, когато се прилага обеззаразяване, като формалинова обработка на апаратурата, и за останалия изкуствен стомашен сок при положителни резултати;

- везни с точност до 0,1 г.

2. Събиране на мускулни късове

При цели трупове се взема мускулен къс от около 2 г от диафрагмения ствол при прехода към сухожилната част.

При отсъствие на диафрагмени стволове мускулен къс със същия размер се взема от ребрената част или гръдната част на диафрагмата, от масетерите или междуребрените мускули.

За парчета месо се взема проба от около 2 г от скелетния мускул с малко тлъстина и по възможност близко до костите или сухожилията.

3. Методика

Пълни вани (100 проби наведнъж):

- 100 проби от около 1 г всяка, взети от всяка от индивидуалните проби в съответствие с т. 2, се поставят в миксера "Мулинет"; миксерът трябва да се пуска три-четири пъти, всеки път за около 1 секунда;

- накълцаното месо се прехвърля в 3-литрова стъкленица и се поръсва с 10 г пепсин; два литра чешмяна вода, предварително затоплени до 46 - 48 градуси С, се доливат в стъкленицата заедно с 16 мл хидрохлорна киселина;

- мелещият прибор на миксера "Мулинет" се потопява няколко пъти в изкуствения стомашен сок в стъкленицата, за да се отстрани и последното парченце месо;

- бъркалката се поставя в бехера и той се покрива с алуминиево фолио;

- бехерът се поставя върху предварително затоплена плоча на магнитната бъркалка (stirrer) и процесът на бъркането започва; преди да започне обаче, магнитната бъркалка трябва да се настрои така, че да се поддържа постоянна температура от 44 - 46 градуси С през цялото време на операцията; по време на бъркането изкуственият стомашен сок се върти с достатъчно висока скорост, така че да се създаде водовъртеж, без да се разплисква с течността;

- изкуственият стомашен сок се бърка 30 мин. и в края на този период бъркалката се изключва и разтворът се излива през ситото във фуния за утаяване;

- изкуственият стомашен сок се оставя във фунията за 30 минути;

- след 30 минути проба от 40 мл течност бързо се прекарва през мерителния цилиндър или центрофужна епруветка;

- пробата от 40 мл се оставя да постои 10 минути, в края на които чрез засмукване се изваждат 30 мл от повърхностния слой, като се оставят другите 10 мл;

- останалите 10 мл проба с утайка се изливат в легенче за броене на ларви или в петриева паничка;

- след това цилиндърът или центрофужната тръба се изплакват с около 10 мл чешмяна вода, която се добавя към пробата в легенчето или паничката; едва след това пробата се изследва съответно под трихинелоскоп или стереомикроскоп;

- смлените проби трябва да се изследват веднага щом се приготвят; изследването в никакъв случай не трябва да се отлага.

Ако смлените проби не се изследват в рамките на 30 мин. след подготовката им, изкуственият стомашен сок се избистря по следния начин: последната проба от около 40 мл се излива в мерителен цилиндър и се оставя да престои 10 мин., след което 30 мл от повърхностния слой се отстранява, като се оставят 10 мл. Този обем се долива до 40 мл с чешмяна вода. След още 10 мин. утаяване със засмукване се отнемат 30 мл от повърхностния слой, като се оставят отново 10 мл за изследване в петриева паничка или легенче за броене на ларви. Мерителният цилиндър се изплаква с 10 мл чешмяна вода и тази течност се добавя към пробата в петриевата паничка или легенчето за броене на ларви.

Ако се окаже при изследването, че утайката е мътна, пробата се излива в мерителен цилиндър и се долива до 40 мл с чешмяна вода и след това се извършва описаната процедура.

Вани с по-малко от 100 проби

При необходимост могат да се добавят до 15 проби по 1 г всяка към обща вана от 100 проби и да се изследват заедно с тези проби в съответствие с IV, т. 3. За пълна вана трябва да се изследват повече от 15 проби. За вани с до 50 проби изкуственият стомашен сок трябва да се намали до 1 л.

При положителен или съмнителен резултат след изследване на сборна проба от всяко прасе се взема нова проба от 20 г в съответствие с т. 2. Пробите от 20 г от пет прасета се събират и изследват по описаната методика. По този начин ще се изследват проби от пет прасета. Когато се открият трихинели в обща проба от пет прасета се събират нови 20-грамови проби от отделните прасета в групата и всяка се изследва поотделно по описаната методика.

VII. Изследване чрез автоматично смилане на сборни проби по 35 г

1. Апаратура и реактиви:

- нож или ножица за рязане на мускулни късове;

- таблички, разграфени на 50 квадратчета, за проби месо по около 2 г всяка;

- миксер "Трихоматик 35" с вграден филтриращ механизъм;

- разтвор на солна киселина 8,5 %;

- прозрачни поликарбонатни мембранни филтри с диаметър 50 мм и размер на пората 14 m;

- активност на пепсина: 1:10 000 NF (национална формулировка на САЩ), съответстваща на 1:12 500 ВР (по Британската фармакопея), съответстваща на 2000 FIР (международна федерация по фармация);

- везни с точност до 0,1 г;

- пинсети с плосък връх;

- няколко предметни стъкла с дължина на страната най-малко 5 см или няколко петриеви панички с диаметър най-малко 6 см, маркирани с остър инструмент от долната страна с квадратчета 10 x 10 мм;

- стереомикроскоп с вградено (изкуствено) осветление (увеличение 15 до 60 пъти) или трихинелоскоп с хоризонтална плоча;

- кофа за отпадъчни течности;

- няколко 10-литрови кофи, които се използват при обеззаразяване на апаратурата и за останалия изкуствен стомашен сок при положителни резултати (напр. обработка с формалин).

2. Събиране на мускулни късове

При цели трупове се взема мускулен къс от около 2 г от диафрагмения ствол при прехода към сухожилната част.

При отсъствие на диафрагмени стволове мускулен къс със същия размер се взема от ребрената част или гръдната част на диафрагмата, от масетерите или междуребрените мускули.

За парчета месо се взема проба от около 2 г от скелетния мускул с малко тлъстина и по възможност близко до костите или сухожилията.

3. Методика

Процедура по смилането:

- монтира се миксерът с филтриращото устройство, свързва се тръбичка към кофата за отпадъци;

- когато се включи миксерът, започва загряването и клапанът на дъното, разположен под камерата за реактивите, трябва да се отвори и затвори;

- след това се добавят до 35 проби от около 1 г всяка, взети от всяка индивидуална проба в съответствие с т. 2; проверява се дали по-големите парчета сухожилия са отстранени, защото това може да задръсти мембранния филтър;

- долива се вода до ръба на камерата за течности, свързана с миксера (приблизително 400 мл);

- долива се около 30 мл солна киселина (8,5 %) до ръба на по-малката свързана камера за течности;

- поставя се мембранният филтър под грубия филтър в приспособлението за филтрите във филтърното устройство;

- накрая се добавят 7 г пепсин; редът на добавянето строго се спазва, за да се избегне разлагането на пепсина;

- затварят се капаците на камерите за реактивите и течностите;

- подбира се време за смилането; краткият период (5 мин.) е за прасета на нормална възраст за клане, а по-дългият период на смилане - за другите проби;

- пускането в действие е автоматично, като се натисне копчето на блендера ad hoc, смилането, последвано от филтрирането, автоматично започва;

- след 10 до 13 мин. миксерът автоматично изключва и процесът спира; отваря се капакът, ако се установи, че камерата е празна; ако има пяна или остатъци от смилателната течност в камерата, процесът се повтаря.

Изолиране на ларви:

- демонтира се държачът на филтъра;

- мембранният филтър се изследва с помощта на микроскоп или трихинелоскоп.

Почистване на оборудването:

- при положителен резултат камерата на миксера се напълва с гореща вода до две трети; долива се чешмяна вода в свързващата камера, докато се покрие нивото на сензора; провежда се програмата за автоматично почистване; почиства се държачът на филтъра, както и останалата част от апаратурата, напр. по общоприетите методи;

- след приключване на работния ден камерата за течности в миксера се напълва с вода и се провежда стандартната програма.

Използване на мембранни филтри

Всеки поликарбонатен мембранен филтър се използва не повече от 5 пъти. След всяка употреба филтърът се обръща.Освен това филтърът се проверява след всяка употреба за повреди, които биха могли да го направят негоден за по-нататъшна употреба.

Методика, използвана при непълно смилане и невъзможност за филтриране. Когато автоматичният процес в миксера се провежда съгласно т. 3, се отваря капакът на камерата за реактивите и се проверява дали в камерата има пяна или останала течност. В такъв случай се провежда следната процедура:

- затваря се дънната клапа под камерата за реактивите;

- демонтира се държачът на филтъра и мембранният филтър се пренася върху предметно стъкло или петриева паничка;

- поставя се нов мембранен филтър в държача и последният се монтира;

- напълва се вода в камерата за течности на миксера, докато се покрие долното ниво на сензора;

- провежда се програмата за автоматично почистване;

- след като завърши програмата за почистване, се отваря капакът на камерата за реактиви и се проверява дали е останала течност;

- ако камерата е празна, се откачва държачът на филтъра и се прехвърля мембранният филтър с пинсета върху предметно стъкло или петриева паничка;

- двата мембранни филтъра се изследват съгласно т. 3; ако филтрите не могат да бъдат изследвани, се повтаря целият процес на смилането с удължено време.

При положителен или съмнителен резултат след резултата от общата проба от всяко прасе трябва да се вземе нова 20-грамова проба. Тези проби трябва да се изследват по описаната методика.

II. Методика 2

Спазват се общите условия на т. 1 до 5 на методика 1. Освен това се използват и следните комбинации време-температура:

1. Месо с диаметър или дебелина до 15 см се замразява според една от следните комбинации време-температура:

- 20 дни при - 15 градуси С;

- 10 дни при - 23 градуси С;

- 6 дни при - 29 градуси С.

2. Месо с диаметър или дебелина между 15 и 50 см се замразява според една от следните комбинации време-температура:

- 30 дни при - 15 градуси С;

- 20 дни при - 25 градуси С;

- 12 дни при - 29 градуси С.

Температурата в помещението за замразяване неможе да бъде по-висока от нивото на избраната температура за дезактивация. Тя се измерва с калибрирани термоелектрични уреди и постоянно да се записва. Температурата не се измерва директно на притока на студен въздух. Уредите се държат под ключ. Диаграмите трябва да включват съответните номера от регистъра по инспекцията на месото при вноса и датата и времето на започване и завършване на замразяването и се съхраняват една година след това.

III. Методика 3

Контролиране на температурата в центъра на парчетата месо.

1. Прилагат се следните комбинации време-температура, когато температурата се контролира в центъра на месните късове и се изпълняват условията по т. 2 до 6:

- 106 часа при - 18 градуси С;

- 82 часа при - 21 градуси С;

- 63 часа при - 23,5 градуси С;

- 48 часа при - 26 градуси С;

- 35 часа при - 29 градуси С;

- 22 часа при - 32 градуси С;

- 8 часа при - 35 градуси С;

- 1/2 час при - 37 градуси С.

2. Месо, внесено замразено, трябва да остане в същото състояние.

3. Отделните пратки в помещението за замразяване се съхраняват отделно и под ключ.

4. Датата и времето, когато се доставя всяка пратка в хладилната зала, се записват в дневник.

5. Техническите съоръжения и електроснабдяването за хладилното помещение трябва да осигуряват температурата съгласно т. 1 да се достига много бързо и да се задържа еднаква във всички части на месото.

6. Температурата се измерва с калибрирани термоелектрически уреди и постоянно се записва. Краят на термометъра се поставя в центъра на едно калибрирано парче месо, което ще се замразява. Това калибрирано парче месо се поставя на най-благоприятното място в хладилната зала - да не е близо до хладилното съоръжение или директно пред студения въздух.

Инструментите се държат под ключ. Диаграмите трябва да съдържат съответните номера от регистъра за инспекцията на месото при внос и датата и времето на началото и края на замразяването и се съхраняват една година след това.